自噬在帕金森病増龄易感性中的作用及机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目自噬在帕金森病増龄易感性中的作用及机制研究研究生姓名杨亚萍指导教师姓名刘春风教授胡丽芳副教授专业名称神经病学研究方向神经退行性疾病基础研究论文提交日期2013年3月自噬在帕金森病増龄易感性中的作用及机制研究中文摘要中文摘要第一部分自噬应激参与了多巴胺能神经元的损伤机制目的构建C57BL小鼠1-甲基，4-苯基，1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl–4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）急毒模型，观察帕金森病（Parkinsondisease，PD

2、）小鼠中的自噬水平，并深入研究自噬在PD发病机制中的作用。方法14mg/kgMPTP腹腔注射（1d内分4次注射，每次间隔2h），构建C57BL小鼠MPTP急毒模型；同时采用雷帕霉素4mg/kg腹腔注射预处理给药3次作为自噬诱导剂预处理组。在造模后第7d对各处理组小鼠进行行为学评定（小鼠爬杆检测、小鼠转棒耐力检测）。免疫组织化学染色观察小鼠黑质及纹状体TH蛋白表达变化，透射电镜观察中脑黑质细胞超微结构变化。Westernblot检测中脑黑质TH和α-synuclein蛋白表达变化，自噬特异性蛋白微管相关膜蛋白轻链3（microtubule-asso

3、ciatedproteinlightchain3，LC3）和自噬底物蛋白P62的表达变化。结果（1）MPTP造模7d可引起小鼠爬杆时间延长，转棒潜伏期缩短，自噬诱导剂雷帕霉素可缓解MPTP导致的小鼠行为学功能损伤。（2）MPTP造模7d后，小鼠黑质及纹状体TH阳性细胞减少，且中脑黑质TH蛋白表达显著降低，α-synuclein表达增加，而自噬诱导剂雷帕霉素可缓解MPTP导致的小鼠DA能神经元损伤。（3）MPTP造模7d，小鼠中脑黑质可见线粒体肿胀损伤，同时可见双层膜的自噬体结构，而雷帕霉素预处理组可见较多的自噬体结构和溶酶体。（4）MPTP造模7

4、d小鼠中脑黑质LC3-II蛋白表达增加，P62的表达也显著增加；雷帕霉素预处理可进一步上调LC3-II蛋白表达，同时减少P62蛋白的表达。结论MPTP引起的自噬应激参与了PD小鼠的发病机制。自噬诱导剂雷帕霉素预处理可上调自噬水平，促进自噬流完成，改善MPTP引起的自噬功能障碍，促进α-synuclein自噬降解从而对DA能神经元发挥保护作用。关键词帕金森病；1-甲基，4-苯基，1，2，3，6-四氢吡啶；自噬应激；α-synuclein；微管相关膜蛋白轻链3；P62I中文摘要自噬在帕金森病増龄易感性中的作用及机制研究第二部分自噬在帕金森病増龄易感性

5、中的作用目的构建不同月龄C57BL小鼠MPTP急毒模型，观察MPTP对不同月龄组PD小鼠的损伤作用，并研究自然増龄条件下自噬水平的变化及自噬在不同月龄PD小鼠发病机制中的作用。方法3月龄和16月龄C57BL小鼠，均分为生理盐水对照组和PD模型组。在造模后第1、4、7天对各处理组小鼠进行行为学评定（小鼠爬杆检测、小鼠转棒耐力检测）。MPTP造模7d后免疫组织化学染色观察小鼠黑质及纹状体TH蛋白表达变化，透射电镜观察中脑黑质细胞超微结构变化，Westernblot检测中脑黑质TH和α-synuclein蛋白表达变化，自噬特异性蛋白LC3、自噬底物蛋白

6、P62和组蛋白去乙酰化酶6（Histonedeacetylase6，HDAC6）蛋白的表达变化。结果（1）与3月龄PD小鼠相比，16月龄PD小鼠在MPTP造模后1、4、7d爬杆时间均显著延长，且在MPTP给药第7d具有显著统计学差异；但小鼠转棒潜伏期在不同月龄PD小鼠没有统计学差异。（2）MPTP造模后7d，与3月龄PD小鼠相比，16月龄PD小鼠黑质和纹状体TH阳性细胞的缺失较为明显，TH蛋白表达也较低，α-synuclein的表达则显著增加。（3）MPTP造模7d后16月龄小鼠中脑黑质细胞内可见较多的脂褐素沉积，线粒体肿胀空泡化，且可见较多的变

7、性神经元。（4）与3月龄生理盐水对照组相比，16月龄生理盐水对照组LC3-II和HDAC6的表达下降，P62的表达增加。（4）MPTP造模7d后，与16月龄生理盐水对照组相比，16月龄PD小鼠LC3-II、P62和HDAC6的蛋白表达虽有增加但没有统计学差异；且与3月龄PD小鼠相比，16月龄PD小鼠LC3-II和HDAC6的蛋白表达显著下降。结论老化可加剧DA能神经元损伤，16月龄小鼠对MPTP诱导损伤存在较高的敏感性。小鼠中脑黑质的自噬水平存在随龄性下降趋势。在3月龄小鼠中HDAC6介导的自噬应激可减弱MPTP引起的毒性作用，而16月龄小鼠的自

8、噬失代偿导致了老龄小鼠对MPTP毒性作用的増龄敏感性。关键词帕金森病；1-甲基，4-苯基，1，2，3，6-四氢吡啶；増龄；自噬应激；α-