鱼类培养细胞抗病毒基因差减cdna文库的构建

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1、第27卷第2期水生生物学报Vol.27,No.22003年3月ACTAHYDROBIOLOGICASINICAMar.,2003鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建张义兵石耀华桂建芳(中国科学院水生生物研究所;淡水生态与生物技术国家重点实验室,武汉430072)摘要:紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素,从而诱导宿主细胞基因表达的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞mRNA,利用抑制性差减杂交技术,成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库。以鲫管家基因A-tubulin和B-actin作为差减

2、指标,检测157差减cDNA文库的差减效率分别高达2和2倍,表明经过病毒诱导后的细胞中,某些差异表达基因的富集效率也15接近2倍。鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的建立对快速分离、克隆鱼类抗病毒相关基因和认识鱼类细胞抗病毒免疫的分子机理有重要意义。关键词:鱼类;草鱼出血病病毒;抗病毒相关基因;诱导;抑制性差减杂交中图分类号:S941141文献标识码:A文章编号:1000-3207(2003)02-0113-006鱼类病毒病是严重影响当今世界水产养殖产量疫反应的基因或抗病毒基因,丰富鱼类抗病毒免疫的主要制约因素之一。长期以来对鱼类病毒病仍无机理的认识,而且克隆的抗病毒基因可以直接应用有效

3、的防治方法,较为成功的是使用疫苗。目前能于鱼类基因工程的抗病毒育种探索。本文报道运用够用于养殖的病毒疫苗极为有限,而且某些疫苗虽SSH技术建立鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的结能有效控制病毒病,但仍然不能彻底根治鱼类病毒果。[1]病的危害。使用疫苗除费时、费力,不适于大面积1材料与方法水面养殖外,还可能由于病毒抗原漂移和新毒株的出现、以及母源抗体的干扰等原因导致疫苗接种失111细胞与病毒鲫囊胚细胞系(Blastulaeembry-[1,2][9]败。而分离鱼类自身抗病毒基因、构建转基因oniccellsofcruciancarp,CAB)由本实验室建立,草鱼,可能是彻底解决鱼类病毒病

4、的最为理想途径。鱼肾细胞系[Kidneyofgrasscarp(Ctenopharyngodon然而,在鱼类目前不仅没有得到有效的抗病毒idellus),CIK]由中国水产科学院长江水产研究所建[10]基因,而且对鱼类感染病原后的免疫机制也缺乏了立。细胞用10%新生牛血清(杭州四季青产品,[1]解和认识。抑制性差减杂交(SuppressionSubtrac-使用时56e灭活30min)的TC-199(GIBCO产品)培[9]tiveHybridzation,SSH)技术常用于快速分离和克隆差养基置28e培养。草鱼出血病病毒(Grasscarp[3)5][11]异表达基因。近年来的研究

5、表明,紫外线灭活hemorrhagevirus,GCHV)在CIK细胞上扩增并检的草鱼出血病病毒能诱导多种鲤科鱼类培养细胞高测病毒滴度。[6]效表达干扰素(Interferon,IFN),粗制鲫干扰素对112GCHV紫外线照射灭活CAB细胞干扰素用紫[7]草鱼出血病有较好的防治作用。同哺乳类TypeI外线灭活的GCHV诱导,采用本实验室的灭活装置和[6]IFN一样,鲫干扰素具有广谱抗病毒活性,其抗病毒方法。病毒灭活前先进行初步纯化:6000r/min、4e机制在于诱导宿主细胞基因表达的改变,包括一系离心20min,收集上清,然后24000r/min,4e超速离心列抗病毒基因的表达,致

6、使细胞处于抗病毒状115h,病毒沉淀用适量无血清199培养基稀释,继续[1,8]态。利用SSH技术构建鱼类抗病毒基因cDNA6000r/min离心20min取上清得纯化病毒。然后用紫文库,不仅能快速扫描、鉴定鱼类对病毒感染引起免外线照射灭活5min。常规方法测定病毒灭活前后的收稿日期:2001-12-01;修订日期:2002-11-11基金项目:国家自然科学基金(30200207);武汉青年科技晨光计划(20015005055)资助作者简介:张义兵(1969)),男,湖北省仙桃市人;遗传学硕士;主要从事鱼类遗传学和分子免疫学的研究通讯作者:桂建芳,E-mail:jfgui@ihb.a

7、c.cn114水生生物学报27卷滴度,检测病毒灭活效率。NA文库的构建。113培养细胞总RNA的提取及mRNA的纯化制备差减cDNA的同时,也制备未差减cDNA以2CAB细胞传代于25cm培养瓶,置28e培养4d检测差减文库的差减效率。未差减的cDNA的制备成致密单层。去掉细胞培养上清液,用无血清培养是:在制备TestercDNA连接两种接头时,将刚加好基洗1次,每瓶加入015mL紫外线灭活的GCHV,样还没有进行连接反应的Tester-1和Tester-