罗非鱼lysozyme-c3基因在斑马鱼中的转植研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M100101094上海海洋大学硕士学位论文题目：罗非鱼Lysozyme-C3基因在斑马鱼中的转植研究英文题目：Transferenceoftilapialysozyme-C3geneinzebrafish专业：水产养殖研究方向：水产动物遗传育种姓名：瞿兰指导教师：叶星研究员二O一三年五月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包

2、含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文

3、属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注江世贵南海水产研究所研究员主席梁旭方华中农业大学教授委员邹记兴华南农业大学教授委员罗建仁珠江水产研究所研究员委员朱新平珠江水产研究所研究员委员马冬梅珠江水产研究所研究员副秘书答辩地点科技楼1楼会议室答辩日期2013-05-26上海海洋大学硕士学位论文罗非鱼Lysozyme-C3基因在斑马鱼中的转植研究摘要罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗

4、非鱼属(Tilapia)，是我国重要养殖鱼类之一。近年广东、海南、福建和广西等地区养殖罗非鱼爆发链球病，使我国罗非鱼养殖业的健康发展受到了严重威胁，因此提高罗非鱼的抗病能力成为迫切需要解决的问题。转基因技术为鱼类育种开辟了新的途径。本研究通过比较、筛选出对无乳链球菌具有较强溶菌作用的罗非鱼Lysozyme-C3基因，利用本实验室已分离到的诱导型罗非鱼Hsp70基因启动子，构建了罗非鱼Lysozyme-C3基因表达载体并进行显微注射，观察转植基因在斑马鱼中的表达情况，为转基因培育抗病罗非鱼的研究奠定基础。主

5、要研究内容如下：1．几种鱼虾溶菌酶重组蛋白溶菌活性的比较。采用基因工程重组技术制备了罗非鱼3种C型溶菌酶的重组蛋白，并应用比浊法比较了它们与草鱼C型、G型溶菌酶、斑节对虾C型溶菌酶重组蛋白对无乳链球菌、嗜水气单胞菌等8种细菌的溶菌作用。结果显示6种重组溶菌酶对8种菌均具有溶菌活性，但是溶菌活力强弱不一。罗非鱼C3溶菌酶对革兰氏阳性菌无乳链球菌的溶菌作用最强，草鱼C型与G型溶菌酶次之；所有重组溶菌酶对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌均具较强的溶菌活性。与斑节对虾C型溶菌酶、草鱼C型与G型溶菌酶相比，罗非鱼的C型溶菌

6、酶对嗜水气单胞菌具有较强的溶菌作用，且以C1的溶菌活性最强。2．应用金鱼Tgf2转座酶系统进行Lysozyme-C3基因的转植研究。金鱼Tgf2转座子是近年在金鱼上发现的具有转座活性的转座子。本实验室前期研究中，构建了带罗非鱼Hsp70启动子的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP并证实该启动子具有强诱导活性。本实验利用高保真酶PCR扩增罗非鱼Lysozyme-C3基因开放阅读框并替换该供体质粒中的eGFP基因，获得pTgf2-Hsp70-C3表达载体。然后设计引物扩增此载体上的Hsp70-C3-

7、SV40片段，并将其插入pTgf2-Hsp70-eGFP载体的eGFP之后，从而成功构建了用于斑马鱼转基因的双基因表达载体pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3。3．转Lysozyme-C3基因斑马鱼的获得与检测。采用显微注射方法将携带Hsp70启动子、eGFP基因和C3基因的转座子供体质粒pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3和编码转座酶的mRNA共注射到斑马鱼的受精卵中。注射12h后37℃热激处理1h，I上海海洋大学硕士学位论文28℃孵育，12h后使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧

8、光表达情况，并挑选出呈绿色荧光的斑马鱼阳性个体。共有580个胚胎孵化出膜，其中有261个胚胎有绿色荧光，荧光率达45%。采用RT-PCR在转基因斑马鱼F1代肝脏、肌肉、肠道、皮肤中均可检测到eGFP基因mRNA，但仅在肝脏中检测到Lysozyme-C3基因mRNA。采用Westernblot技术在转基因斑马鱼F1代肝脏中均可检测到eGFP和Lysozyme-C3蛋白条带。分析结果说明，在RNA水平和蛋白水平均能检测到转植基因的