抗牛病毒性腹泻病毒sirna与mirnas功能基因的筛选与评价

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1、分类号：密级：学号：2009208005单位代码：10759石河子大学博士学位论文抗牛病毒性腹泻病毒siRNA与miRNAs功能基因的筛选与评价学位申请人倪伟陈创夫教授指导教师乔军教授申请学位门类级别农学博士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向免疫遗传与抗病机理所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ScreenandevaluationoffunctionalsiRNAandmiRNAgenesagainstbovineviraldiarrheavirusADissertationSubmittedtoShihezi

2、UniversityfortheDegreeofDoctorofAgriculture(AnimalGeneticsBreedingandReproduction)June,2013Shihezi,Xinjiang,China摘要牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheaviruses，BVDV）是牛病毒性腹泻-粘膜病的主要抗原，该病在世界各国都有比较普遍的发生和存在。该病对我国养殖业同样构成严重危胁。因此，国内、外对BVD的防治都非常关注。但是目前针对BVDV感染尚无特异性的预防疫苗、治疗方法和抗病毒药物。因此建立新的

3、抗病毒方法，控制病毒的扩散具有重要意义。利用转基因技术进行抗病育种已成为研究热点，而抗病候选基因的克隆和验证是转基因新品种培育中急待解决的关键问题。本研究从两个角度开展抗BVDV功能基因研究：（1）靶向病毒基因设计siRNA，抑制BVDV增殖为目的，将RNAi技术与转基因技术相结合，进行抗病毒功能基因研究，并在绵羊个体进行抗BVDV效果评价，为制备抗BVDV转基因家畜动物奠定基础；（2）以修饰宿主抗BVDV功能基因，提高BVDV易感动物的抗病性能为目的，通过microRNAs（miRNAs）的差异表达分析，筛选宿主抗BVDV功能基因，

4、为我国抗病转基因新品种培育和产业化提供基因资源。首先，设计靶向BVD病毒Npro、C、NS3、NS4B、NS5A基因的shRNA干扰片段，构建相应的shRNA干扰载体pu6-sh1…pu6-sh9，分别转染MDBK细胞，48h后接种BVDV，Real-timePCR与病毒滴定测定的方法并用，测定干扰载体的抗病毒效率。结果显示pu6-sh3、pu6-sh8的干扰效果较好，最高干扰效率可达88.5%。为进一步提高干扰效率，应对病毒变异而产生的逃逸现象，将sh3、sh8的表达框连接到同一载体上，结果显示干扰效率可以提高到92.6%。将sh3

5、-sh8表达框连接到转基因表达载体，构建靶向BVDVshRNA转基因载体pNeo-2loxp-u6-shBVDV，转染绵羊胎儿成纤维细胞，筛选稳定表达sh3-sh8基因框的细胞克隆，经PCR鉴定后，共获得阳性细胞克隆12株，经Real-timePCR与病毒滴定测定，有5株阳性细胞克隆抗病毒效果较好，可用于核移植的供体。供体细胞注入体外成熟培养的去核卵母细胞中，电融合后进行体外培养，2-8细胞期的胚胎进行胚胎移植。卵母细胞平均成熟率可以达到77.24±0.52%，重构胚的平均卵裂率为68.12±0.41%，先后共将589枚不同发育阶段的

6、克隆胚胎移植到27只受体绵羊体内。2011年移植的12只绵羊中，获得一只流产胎儿，PCR鉴定结果呈阳性。分离流产胎儿皮肤成纤维细胞和肾上皮细胞，接种牛病毒性腹泻病毒NADL株和C24V株，经Real-timePCR与病毒滴定测定，均有良好的抗BVDV的效果。这部分研究为进行抗BVDV转基因动物探索奠定基础。为了探讨宿主细胞抗BVDV机制，筛选影响病毒释放的宿主抗病毒功能基因，本研究通过高通量测序技术获得BVDV感染与未感染的MDBK细胞miRNAs差异表达谱。miRNAs差异表达分析结果显示：BVDV感染的细胞与正常细胞相比，26个m

7、iRNAs表达量显著上调，2个miRNAs表达量显著下调，生物信息学预测结果显示miR-1249与细胞凋亡密切相关。Hoechst染色、流式细胞仪检测、caspase酶活性检测结果显示，miR-1249可促进细胞凋亡。WB、荧光素酶报告基因检测系统分析结果显示miR-1249可以靶向抑制Faim2蛋白的表达。揭示miR-1249通过抑制死亡受体凋亡通路中Faim2I蛋白的表达促进细胞凋亡、病毒释放，有利于宿主细胞清除病毒感染，为从提高宿主自身抗病毒能力角度出发，研究抗BVDV转基因育种材料提供科学理的论依据。IIAbstractBov

8、ineviraldiarrheavirus(BVDV)isanimportantanimalpathogenwhichresultsinbovineviraldiarrhea-mucosaldisease.BVDVisa