含hiv-1+env基因质粒dna及重组腺病毒载体疫苗的研究

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1、摘要摘要自从上世纪80年代发现HIV以来，科学家一直在进"：『yHIV疫苗的研究，但是由于HIV高度的基因变异性和其独特的特性，直到现在仍然没有有效的疫苗问世，HIV给人类医学带来了巨大的挑战。研制出一种安全、有效、价廉的艾滋病疫苗来预防控制艾滋病的传播迫在眉睫。本研究的目的是分析河南地区有偿献血者HIV．1el'Iv基因序列，对获得的共有序列进行基因优化；构建含密码子优化的gpl60共有序列的质粒DNA疫苗和重组腺病毒疫苗，期望两种疫苗联合应用能诱导高水平的细胞免疫反应和有中和作用的保护抗体。本文首先应用套式聚合酶链

2、反应(nested．PCR)从60例河南省HIV．1抗体阳性有偿献血者外周血单个核细胞DNA样品中扩增全长erlv基因，将扩增的基因连接至r]pGEM．T载体上进行序列测定。共扩增至tJ21个全长eYl'g基因，序列分析发现其中15个el,Iv基因有完整的开放读码框(ORF)，14个为B’亚型，与国际参考株RL42的基因离散率为4．87％+0．31％，1个为B亚型，与国际参考株HXB2的基因离散率为5．43％。根据核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列，并对重要的功能结构域进行了深入的分析和比较。发现15个序列的N糖基化位点

3、和数目没有显著变化；CD4受体结合位点高度保守；根据V3环氨基酸序列及静电荷数目预测13分离株使用CCR5辅助受体，2个分离株使用CXCR4辅助受体；V3环四肽序列以GPGR这一典型欧美B亚型最多，占40％；Gpl20／Gp4l剪切位点高度保守，预测所有Gpl60前体都能有效剪切；2G12、IgGlbl2、4E10及2F5四种广谱中和抗体识别位点高度保守，表明大多数分离株对上述中和抗体敏感。按照人类密码子使用频率表对来源于上述15个具有完整开放读码框的gpl60基因的共有序列进行优化并全基因合成。把优化后的基因构建到质

4、粒pVR中获得了DNA疫苗，WesternBlot检测发现优化后的gpl60基因能很好的表达。同时也将优化的基因构建到重组腺病毒的穿梭质粒pDC316中，并和骨架质粒共转染293细胞包装出携带gpl60基因的重组腺病毒疫苗。gpl60基因同样能在rAdV疫苗中有效表达。将DNA疫苗，重组腺病毒疫苗单独和联合免疫小鼠，分别用ELISPOT和ELIISA检测小鼠的细胞免疫反应和体液免疫反应。在细胞免疫方面，在最后一次免疫后l周时以DNA疫苗初免，rAdV疫苗加强免疫诱导的细胞免疫反应最强(296SFC／2×105PBMCs

5、)，但是随着时间的推移细胞免疫反应大幅度的降低；而DNA单独免疫引起的细胞免疫反应在最后一次免疫后l周时稍弱，但到4周后由于其诱导的细胞免疫反应下降缓慢，和其它组相比则最强。在体液免疫反应方面，DNA疫苗，腺病毒疫苗单独及联合免疫诱导的体液免疫反应都很低，其中rAdV疫苗单独免疫效果优于其它各组，在最后一次免疫后1周和4周时rAdV疫苗单独免疫组OD450／630均值分别为0．4084(1：100稀释血清)和0．8645(1：400稀释血清)。北京工业大学理学硕士学位论文]．II：1

6、曼曼蔓曼!曼曼鼍!曼曼!曼苎!!曼

7、曼曼!!曼!!曼!!曼曼曼!!皇!!曼曼!皇!!!曼!曼曼皇曼曼皇!曼曼曼曼曼曼鼍!曼!曼我们的数据表明携带Env蛋白的DNA和rAdV疫苗可以诱导出很高的细胞免疫反应，但是很难诱导出高水平的体液免疫反应，尤其是具有中和作用的抗体。因此，绕过抗原免疫而直接用基因治疗载体在体内表达具有广谱中和作用的抗体可能是一种比较好的疫苗设计思路，目前我们正在进行这方面的探索。关键词HIV．1；gpl60；rAdV；细胞免疫反应；体液免疫反应VABSTRACTScientistshavebeenfocusingonthestudyof

8、HIVvaccinessinceHIVwasidentifiedin1980’S．However，theenormrousgeneticdiversityandotheruniquefeatureoftheHIVhavethusfarthwartedattemptstoidentifyaneffectivecandidatevaccine．ThedevelopmentofanHIVvaccineposesallunprecedentedchallengetothescientificcommunity．Asafe，ef

9、fectiveandaccessibleHIVvaccineiSurgentlyneededtocontrolandpreventtheprevalenceofHIV．ThemainobjectivesofourstudiesaregeneticanalysisofthecompleteenygenesofHIV一1frompai