dmd基因诊断体系建立、应用和羊水ipscs构建

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1、南方医科大学2010级博士学位论文DMD基因诊断体系建立、应用和羊水iPSCs构建TheestablishmentandapplicationofageneticdiagnosissystemforDMDandthegenerationofiPSCsfromamnioticfluid课题来源：广州市科技攻关2011学位申请人黎青导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院余艳红教授妇产科学专业学位博士南方医院2013年O3月31广州博士学位论文建立、DMD基因诊断体系应用和羊水iPSCs构建博士研究生：黎青指

2、导教师：余艳红教授摘要假肥大型肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy／Becker’SMuscularDystrophy，DMD／BMD)是最常见的X-连锁隐性致死性遗传病之一，由Duchenne等(1868年)首先报道，故得其名。本病的群体发病率高达1／3500活产男婴，是一种预后不良的常见的原发性肌肉疾病。典型的临床特征是进行性肌萎缩、肌无力伴小腿腓肠肌的假性肥大，通常累及青少年男性，一般在12岁以前丧失站立和行走的能力，最后因心肌以及呼吸肌无力而多于20岁前死于心力衰竭或呼

3、吸衰竭。本病严重影响了青少年男性的健康成长，同时也给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。本病基因定位在人类X染色体短臂Xp21上，DMD基因突变是本病各型临床亚型患者发病的共同的分子遗传学基础。DMD基因突变的主要形式有三类：缺失型突变、重复型突变和点突变，前两种突变约占了全部基因突变的70％，点突变约占30％。而所有的突变中约70％遗传自母亲，约30％没有家族史，为新发突变。国内外至今尚缺乏对于本病有效的治疗措施，因此，对先证者进行确诊、对携带者进行产前诊断以杜绝患儿出生的出生缺陷干预措施仍然是目前国

4、内外假肥大型肌营养不良症遗传优生关键之所在。在基因诊断技术开展以前，本病的临床诊断除依靠典型的症状和体征外，还需要结合肌电图、酶生化检查和肌肉活检等辅助性检查，其中肌电图显示肌源中文摘要性损害及酶生化检查发现肌酶活性显著增高是较可靠的临床诊断依据。但上述血清酶的增加特异性并不高，并且存在假阳性和假阴性，而且不能应用在胎儿的产前诊断上，导致在临床上应用受到一定的限制。随着DNA研究技术的发展，各种基因诊断的手段也被应用到假肥大型肌营养不良症的检测中来。国外DMD基因诊断的主要手段有：Southern印迹杂交

5、技术、DMD基因多重PCR技术、短串联重复序列PCR技术及反转录PCR技术。Chamberlain等设计了9对引物的多重PCR，可检出80％的DMD基因缺失型患者；Beggs等增设了另外9对引物多重PCR，这18对引物总共可以检出98％的DMD基因缺失型患者。但这种方法的局限是不能检测出基因缺失型和基因重复型的杂合子携带者。Prior等最先应用定量PCR原理诊断了杂合子携带者。短串联重复序列PCR技术也被用于非缺失型家系的基因连锁分析。DMD产前基因诊断是一个比较复杂的难题，我们以前主要采用性别诊断、多重

6、PCR缺失突变分析、STR单体型连锁分析等方法进行。这些方法有一定的局限性，不能很好地适应产前诊断的需要。单一的性别诊断会导致正常的男性胎儿被淘汰掉。由于存在高达11％的基因内交换率，理论上STR单体型连锁分析结果具有可高达11％假阳性或假阴性率，因此，这种单体型连锁分析诊断结果只是一种概率性诊断，有时也因缺乏先证者和杂合信息或家系过小而无法展开连锁分析。多重PCR方法所得到的遗传信息量不够大，容易导致漏诊，而且不能检测出重复突变，也不能检测出杂合子携带者。鉴于上述缺陷，建立各种DMD基因杂合子非概率性确

7、诊技术就成为最终解决DMD杂合子携带者诊断的关键，是DMD产前基因诊断的前提条件。针对DMD基因三大类突变类型，我们拟建立高效、省时的针对DMD基因全部79个外显子的缺失型、重复型和点突变型基因突变的检测方法，对患者以及携带者作出正确的诊断，并将其应用于产前诊断；探索产前诊断时机前移的可行性，以达到早期诊断、杜绝患胎出生、优生优育的目的。本研究应用多重连接依赖性探针扩增(MultiplexLigationdependentProbeII博士学位论文Amplification，MLPA)等方法对DMD先证者

8、及其母亲进行检测，筛选出准备生育下一胎的DMD携带者进行产前基因诊断，检测DMD全部79个外显子的缺失型与重复型突变，建立准确的DMD患者和杂合子携带者的基因诊断技术；建立改良的96孔板一步全外显子测序方法，用于点突变型DMD基因突变的检测和产前诊断；摸索高分辨溶解曲线(HighResolutionMelting，HRM)用于DMD突变的初筛方法；摸索单卵裂球的全基因组扩增方法，为下一步开展胚胎种植前遗传学诊断和筛查(PGD／