猪mitf基因转录调控区域克隆及活性分析

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationCloningandActivityAnalysisofPigmicrophthalmia-associtatedtranscriptionfactor(MITF)GenePromoterAuthor：ZhangTinghuanSupervisor：Prof．ShuaiSurongMajor：AssociateProf．ChenLeiAnimalBreedingandGeneticsSpecialty：PigBreedingandGeneticsJune，20

2、14万方数据论文指导小组成员二㈣删㈣洲㈣删J0121509蓝静(博士)重庆市畜牧科学院潘红梅(副研究员)重庆市畜牧科学院本论文由国家自然科学基金项目：中国荣昌猪遗传性听力缺陷家系致聋基因定位(项目编号：3l101701)资助本论文在农业部养猪科学重点实验室完成兀从万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己

3、在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：声n堤加f毕年多月一日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“v”)研究生签名：斑碰导师签名：c．，僻需，I⋯矽中年多FJ，矿日讪I中年参R{口B万方数据摘要本试验用基因克隆、测序、双荧光素酶报告系统和干

4、扰RNA等方法，研究了猪MITF-M基因的转录调控区域序列及其转录活性与功能，得到了如下结果：1、从藏猪基因组中调取了含有MITF基因的scarffords，将其作为参考序列设计了3对相互重叠的引物，通过PCR克隆测序，首次获得猪MITF．M转录调控区约7．8kb的序列。2、根据测序得到的MITF-M调控区序列设计引物，利用“巢式”PCR克隆转录调控区域片段，通过酶切、连接、转化，成功构建并验证了猪MITF-M基因转录调控区域的10段5’端缺失报告基因载体：PGL3．1140、PGL3．1397、PGL3．2470、PGL3—3487、PGL3。3753、PGL3．520

5、1、PGL3．5429、PGL3．6036、PGL3．6274、PGL3．6416。3、将所构建的10个载体转染到B16细胞，48小时后，利用双荧光素报告系统检测10个载体的荧光素酶活性，确定了MITF-M转录调控区存在两个重要核心区域，分别位于．2470～-3487bp的负调控区和⋯54296036bp的正调控区。4、利用转录因子预测软件JASPAR和干扰RNA法，发现并验证了⋯24703487bp区域的KLF4结合位点及KLF4对MITF-M的转录活性的双重调控作用。该研究结果为进一步研究猪MITF基因的表达机制奠定了基础，对深入研究猪MITF-M转录调控区域的活性和

6、表达调控机理具有重要意义。关键词：MITF；转录调控区；转录因子：转录活性；KLF4万方数据AbstractUsinggeneclqning,sequencing，dualluciferasereport-systemandRNAinterference，thisexperimentstudiedthepromoterregionsofpigMITF-Mgene,Andtheresultsareasfollows：1，WegotthescarffordscomainingtheMITFgenefromtheTibetanpiggenome．AndWedesignedpri

7、mersusingscarffordsasreferencesequence．Thenweusedthreepairsofoverlappingprimerstocloneabout7．8kbtranscriptionregulatoryregionsofpigsMITF-MwithusingPCRmethod．ThisisthefirsttimethatweobtainthetranscriptionregulatoryregionsofpigsMITF-M．2，AccordingtothesequenceofMITF-Mr