膝沟藻毒素gtx2,3单克隆抗体的制备及酶联免疫快速检测法的建立

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1、学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：、移／钐娣』珠鸽键愀、私吞新铆广东海洋大学fH丫zI

2、8／J6lHl3IHIN鲤Iml／W／lU／学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：砍小杏砧年z月f1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子

3、版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在——年解密后适用本授权书。2、不保密囱。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：礅小蕾导师签名为盘年彳月fJ日劬f眸6月f1日膝沟藻毒素GTX2，3单克隆抗体的制备及酶联免疫快速检测法的建立摘要膝沟藻毒素2，3(gonyautoxin2&3，GTX2，3)是一类氨基甲酸酯类麻痹性贝类毒素(PSP)，具有分布广、毒性强、对人体危害严重等特点，是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的主要毒素之一，严重威胁广东沿海海域

4、贝类的食用安全。本研究主要采用乙二醛作为偶联剂将小分子GTX2，3分别与载体蛋白BSA和KLH进行蛋白偶联，制备完全免疫抗原和检测抗原，通过完全抗原的偶联鉴定、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞株克隆化培养技术及小鼠体内诱生法制备抗GTX23单克隆抗体，并对反应条件进行优化，建立了GTX2，3间接竞争ELISA酶联免疫快速检测法。实验结果如下：(1)本实验采用乙二醛作为偶联剂将小分子GTX2，3分别与载体蛋白BSA和KLH进行蛋白偶联制备完全免疫抗原和检测抗原，并通过BCA蛋白浓度测定、紫外扫描、变性SDS．PAGE凝胶电泳和抗原免疫原性等鉴定方法，证明成功制备了具有较强免疫原性的GTX2，3完

5、全抗原，其中免疫抗原的蛋白浓度为8．52mg／mL、分子偶联比为15：1，检测抗原的蛋白浓度为5．72mg／mL，通过间接ELISA检测免疫4次后的小鼠血清效价达到1：51200。(2)分别采取足垫及腹腔注射免疫、颈背部皮下多点免疫、腹腔注射免疫和快速免疫佐剂肌肉注射免疫共四种不同免疫方法免疫6—8周龄健康的雌性BALB／c小鼠，最高的小鼠抗血清效价分别为1：25600、1：51200、1：102400和1：51200。摘取不同免疫方案中抗血清效价最高的小鼠脾细胞与复苏的SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合。采用细胞融合技术及有限稀释克隆技术成功筛选出3株能稳定分泌抗GTX2，3的阳性杂交瘤细胞

6、株2-2H11、3-2F2和3-3C9，杂交瘤细胞上清液效价分别为1：128、1：64和1：256，经小鼠单抗亚类试剂盒鉴定，抗体亚类均为IgGl。并通过小鼠体内诱生腹水法、辛酸一硫酸铵法(CA．AS)和ProteinA株亲和层析纯化法、BCA蛋白浓度测定、间接ELISA法和单抗亚类鉴定，最终选择抗GTX2，3单克隆抗体亚类为IgGl、抗体效价高达!：102400、抗体的亲和常数为1．05×108L／mol的具有良好的特异性的GTX2，3．3—3C9腹水单抗，用于后续的GTX2，3间接竞争ELISA方法的建立。(3)利用抗GTX2，3单克隆抗体3-3C9建立的检测GTX2，3间接竞争ELIS

7、A方法的线性回归方程为Y=．14．821x+98．544，相关系数R=0．9942，灵敏度(IC50)为1．65399／mL，线性检测范围(IC20．ICso)为0．277—9．852／．tg／mL，检测限为0．136I．tg／mL。用本实验所建立的用GTX2，3一ic．ELISA计算的香港牡蛎的加标回收率为90．05％．113．7％，波纹巴非蛤的为94．55％．106．0％；用HPLC计算的香港牡蛎和波纹巴非蛤的加标回收率分别为97．98％．103．3％和96．90％．101．9％。两者的加标回收率均在80％一120％范围内，说明所建立的GTX2，3．ic．ELISA在一定浓度范围内具有与

8、HPLC法一样的准确度。关键词：膝沟藻毒素GTX2，3，完全抗原，单克隆抗体，间接竞争ELISAIIPreparationofMonoclonalAntibodyagainstGTX2，3andEstablishmentofiC．ELISAforGTX2，3DetectionAbstractGTX2，3isakindofcarbamatetoxinsofparalyticshellfishpoison(PSP