重组呼吸道合胞病毒g蛋白基因工程菌的发酵条件研究

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1、重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究李光，井申荣，岳婷婷，季秀玲，林连兵，魏云林(昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明650224)摘要:目的研究建立呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法：先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB+葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r/min，培养温度为37℃，pH值为7

2、.0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0.01mmol/L，优化后工程菌菌体的产量可以达到39.20g/L，目的蛋白表达率平均为18.1%。结论建立了稳定高效的重组RSVG工程菌发酵工艺。关键词：呼吸道合胞病毒；G蛋白；发酵中图法分类号：文献标识码：4呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，RSV）是婴幼儿呼吸道感染的主要病原体之一[1]，全球每年有近400万儿童受其感染。G蛋白是RSVA、B两亚型病毒具有免疫原性的被膜蛋白之一[2,3]，主要介导病毒与宿主之间的黏附，也是目前开发抗RSV药物和疫苗的一个重要靶蛋白[3,4]。要获得大量的RSV

3、G蛋白，需要通过重组G蛋白的工程菌发酵，一方面提高发酵菌体的湿质量和干质量，另一方面提高目的蛋白的表达产量，同时还要考虑节约原料、降低成本方面的因素。本文对重组RSVG蛋白工程菌的发酵培养基、诱导条件、补料等进行了研究，以建立稳定高效的RSVG蛋白工程菌发酵工艺。1材料与方法1.1材料与试剂工程菌G-pET22b/BL21(DE3)由本实验室构建并保存，BLOFLO410自控发酵罐（美国NBS公司），蛋白胨、酵母抽提物由OXIDE公司提供，IPTG购自Sigma公司，蛋白质定量试剂盒ProteinassayKit购自Bio-Rad公司，其他试剂为国产和进口分装分析纯。LB＋

4、葡萄糖、M9-CAA、M9培养基由本实验室自己配制。1.2方法1.2.1种子菌的活化取冻存于-80℃、含10%甘油保存的菌种50μl，接种于5mlLB培养基中，37℃、200r/min培养过夜，然后按1%转接入50mlLB中，相同的条件培养4～5h，D(600)值达到1.5左右即可成为活化种子。基金项目：昆明理工大学科研启动项目（2005-8）；云南省应用基础面上项目（2007C032M）作者简介：李光，男，辽宁省锦州市人，硕士研究生，主要从事生物制药方面的研究。电话：（0871）3801018,E-mail:liguang820701@126.com通信作者：井申荣，E-

5、mail:jingshenrong@163.com收稿日期：2007-12-16；修回日期：2008-03-111.2.2摇瓶培养在500ml摇瓶中加入LB培养基200ml，取活化的种子，以1%的接种量进行培养。依次对培养基、培养温度、诱导时间、气体条件、及pH等工程菌培养条件进行初步摸索，为发酵做好准备。1.2.3发酵罐培养在发酵罐中，通过分批补料，检测培养过程中菌的干湿质量、目的产物表达效率、培养基中葡萄糖含量等指标，对工程菌的发酵条件进行摸索。1.2.4分析方法工程菌密度测定：取菌液适当稀释后，在600nm波长处测［D(600)］。工程菌干湿质量的测量：Beckman

6、高速离心机5000r/min离心10min，弃去上清，天平测量菌体沉淀质量，沉淀烘干至恒质量后进行测量。菌体总蛋白的测定：紫外分光光度法测定细菌总蛋白。可溶及包涵体的测定：将诱导后的工程菌超声破碎，13000r/min离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，确定是否为可溶性表达。目的蛋白产率分析：留取样本，进行SDS-PAGE，经电泳、染色、脱色、扫描后用Bio-Rad公司的Quantityone软件分析蛋白表达率。1.3统计学分析对每次发酵后的工程菌的湿质量、目的蛋白表达率、可溶蛋白所占比率进行统计学分析，计量资料以±S表示，数据用Excel进行处理。2结果2.1摇瓶培

7、养2.1.1培养基的确定采用LB＋葡萄糖、M9、M9-CAA3种培养基进行培养，培养温度为37℃，用相同的接种量进行培养，所得工程菌D（600）随时间变化（图1）。摇瓶培养12h结束后，菌体湿质量分别为8.5、7.4、3.7g/L，各组之间有统计学差异（P<0.05），表明LB＋葡萄糖为工程菌最适生长培养基。2.1.2培养最适温度的确定在培养过程中采用25、30、37、40℃4种温度进行研究，培养基为LB＋葡萄糖，4摇瓶培养12h结束后，工程菌湿菌量分别为7.6、7.8、8.9、8.1g/L，各组之间有统计学差异（