呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征

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1、浙江人学硕I：学位论文中文摘要呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病(VED)模型建立及G蛋白基因重组质粒免疫特征浙江大学医学院病原生物学硕士研究生余蓓蓓导师钱景副教授、严杰教授中文摘要目的呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体，其感染引起婴幼儿毛细支气管炎和肺炎，并与儿童哮喘的发生发展有着密切关系。接种疫苗是预防和控制传染病最为有效的措施，但RSV至今尚无安全有效的疫苗产生。以福尔马林灭活RSV疫苗(FI．RSV)预防接种的婴儿或学龄前儿童，自然感染RSV后反而导致更为严重的疫苗增强性疾病(Vaccineenhancedd

2、isease，VED)的产生。有研究表明，生化方法提纯的RSVG蛋白免疫和重组G蛋白免疫均有明显的诱导VED效应。另有研究者报道，尽管G蛋白和FI．RSV在免疫病理学方面引起的免疫应答相似，但T细胞介导的应答却不同，即两者引起疾病加重的机理不同。提示G蛋白与VED相关性有待于进一步研究。本研究中我们通过建立福尔马林灭活RSV(FI．RSⅥ疫苗相关VED模型并定义其主要特征，为相关免疫调控机理研究提供平台；构建编码RSVG蛋白基因的重组质粒，观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应，探讨表达的G蛋白抗原与VED的相关性，为探索RSV疫苗接种后疾病加重的相关机制以及为研制安全、有效

3、的RSV疫苗提供线索和实验依据。方法制备RSVAl型Long株FI．RSV疫苗；以FI．RSV免疫BALB／c小鼠后以RSV攻击，收集攻毒前后肺组织、血清标本；采用荧光定量RT-PCR检测肺组织标本中病毒滴度，HE染色法检查肺组织病理改变；采用ELISA检测血清标本中II浙江人学硕l：学位论文中文摘要RSV特异性IgG水平。利用基因重组方法构建含RSVG蛋白编码基因的重组质粒，测序和酶切鉴定，WestemBlot检测目的基因经体外表达后的免疫原性。重组质粒免疫小鼠后以RSV感染，采用上述相同方法分别检测肺组织标本中RSV滴度、肺组织病理改变和血清抗体水平，同时采用双抗体夹心ELISA

4、测定肺泡灌洗液(BAL)内Thl／Th2细胞因子表达量，流式细胞术检测BAL中T淋巴细胞亚群数量及活化状态。结果与对照组相比，FI．RSV免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低，但出现更为严重的肺组织病变，主要是以肺炎，间质性肺炎以及支气管周围炎为主要特征的广泛炎症反应，伴有局部肺气肿。免疫小鼠血清RSV特异性IgG抗体滴度增高，但感染RSV后其滴度明显降低。同时成功构建了编码RSVG蛋白基因的重组质粒pcDNA3．1G。WesternBlot证实目的基因表达蛋白在体外具有免疫原性。被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低，肺组织中未见明显的炎性细胞浸润。小鼠血清中产生较高滴度的抗R

5、SV-GIgG。小鼠BAL细胞中CD4+CD25+T淋巴细胞比例显著增加，并且IFN-丫(Thl)、IL．4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡。结论本研究成功地建立了FI．RSV免疫BALB／c小鼠感染RSV后VED模型，其主要特征为肺组织中出现与病毒滴度、血清抗体水平不一致的严重病理改变；编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒pcDNA3．1G能诱导产生CD4+CD25+T细胞亚群，对小鼠具有明显的保护作用，而未见明显的VED现象产生。关键词呼吸道合胞病毒；疫苗增强性疾病；G蛋白；重组质粒；免疫病理特征；T淋巴细胞III浙江人学硕l：学位论义英文摘要Establisham

6、ousemodeIofvaccine．enhanceddisease(VED)ofrespiratorysyncytialvirus(RSV)anddefim。necharacteristicsofplasmidDNAoelinelmmunecharacteristicsofolasmidDNAencodingGglycoproteinofRSVDepartmentofPathogenBiologyCollegeofMedicalScience,ZhejiangUniversityPostgraduateTutorYuBei．beiProf．QianJing，YanJieAbstrs

7、ctObjectiveRespiratorysyncytialvirus(RSV)isoneofthemostimportantcausesofvirallowerrespiratorytractillnessininfantsandchildrenworldwide．Itcancausebronchiolitisandpneumonia,anditisrelatedtothedevelopmentofchildhoodasthma．Vaccination