铁皮石斛生殖特性及花粉管介导的转基因研究

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1、铁皮石斛生殖特性及花粉管介导的转基因研究专业名称：植物学申请人：冼康华指导教师：黄宁珍研究员论文答辩委员会委员：删铁皮石斛生殖特性及花粉管介导的转基因研究研究生：冼康华年级：201l级导师：黄宁珍研究员学科专业：植物学研究方向：植物分子生物学摘要铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是我国传统的名贵中药材，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用。本论文通过人工授粉，对铁皮石斛进行品种内自交、品种间杂交和种间杂交等有性生殖特性研究，观测其结实情况；并采用SSR分子标记技术，对不同的栽培种群进行遗传

2、分析，探讨遗传多样性与种群育性的可能关联；在此基础上，以含有GFP和GUS基因的质粒和农杆菌为载体，采用花粉管通道法，对铁皮石斛进行转基因技术研究。主要研究结果如下：1．铁皮石斛品种内自交结实率普遍较低，仅为2．7％，但不同品种间差异较大；种内品种间杂交结实率较高，达92。8％；与属内不同种杂交结实率为64．4％。三种方式获得的成熟种子均有良好的萌发能力，无菌播种培养基为1／2MS+NAA0．2rag／L+香蕉6％+AC0．1％(pH6．0)，萌发时间为7～20d。2。铁皮石斛的SSR分子标记分析结果显示，其群体的平均期望杂合度(觑)、平

3、均表观杂合度(协)、Shan．non多样性指数和多态位点百分率分别为0．508、0．792、0．812和100％，遗传多样性较高。种群水平的遗传多样性高低依次为：ZJ种群>GN种群>GL种群>TP种群>YL种群，异交程度高低依次为：GN种群>TP种群>GL种群>Ⅵ。种群>ZJ种群，多数种群的自交结实率与遗传多样性呈正相关、而与父母本的异交程度呈负相关。物种主要的遗传变异存在于种群间(88％)，5个种群中ZJ种群和YL种群遗传距离最小，TP种群与GN种群遗传距离最大，种群遗传距离与种群间杂交结实率关联不大。3．铁皮石斛种子萌发和原球茎生长对

4、不同抗生素的敏感性不同；其中，对卡那霉素的致死浓度分别为90mg／L和150mgm。进一步研究证实，在筛选转化种子和原球茎时，可分别向培养基中添加100m∥L和150mgm的卡那霉素进行选择培养。4．以携带GFP和GUS基因的质粒和农杆菌为载体，通过花粉管通道介导的铁皮石斛转基因技术总结如下：收集携带GFP与GUS基因的质粒(pSuperl300和pBll21)和农杆菌；用无菌去离子水重悬质粒pSuperl300和pBn21至浓度为100ng／pl，用2％蔗糖+1／2MS+O．1％silwet．77+0．1％AS或5％蔗糖+0．1％sil

5、wet-77+0．1mrnol／LAS重悬携带质粒pSuperl300和pBll21的农杆菌至菌液浓度为OD600=0．7～0．8；在授粉后0．5～2，5h内使用柱头滴加法导入携带外源基因的质粒或农杆菌溶液。另外，与农杆菌相比，以质粒为载体进行转化，可获得的更高结实率。5．本研究是铁皮石斛生殖和转基因技术研究的重要补充，研究结果为其物种繁育和种质创新提供重要的理论和技术依据。关键词：铁皮石斛；人工授粉；SSR；遗传多样性；花粉管通道法ResearchonSexualReproductiveCharacterandTransgenebyPo

6、llen--TubePathwayofDendrobiumofficinaleKimuraetMigoMasterCandidate：XianKang··HuaGrade：2011Supervisor：HuangNing-·ZhenMajor：Botanydirection：PlantMolecularBiologyAbstractDendrobiumofficinaleKimuraetMigo，arareandvaluabletraditionalherbinChina,possessesthefunctionssuchasanti-t

7、umor,improvingimmunity,regulatingbloodsugarlevelandanti·agingetc．Inthispaper,thesexualreproductioncharactersandfructificationrateofselfwithinvarieties，hybridizationbetweenvarietiesandbetweenspeciesoftheplantwerestudiedbyartificialpollination．Andthepossibleassociationbetwe

8、engeneticdiversityandfructificationrateofD．officinaleWasexploredbyusingsimplesequencerepeat(SSR)