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1、纳米雄黄对药物敏感性白血病细胞凋亡诱导作用［摘要］目的：研究纳米雄黄对药物敏感性白血病细胞的凋亡诱导作用。方法：采用机械研磨法制备纳米雄黄。以白血病药物敏感K562细胞为靶细胞，采用MTT法检测纳米雄黄对K562细胞的增殖抑制作用，AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡，细胞流式细胞术检测Bax,Bcl-2,P-gp,BCRP,P-53蛋白的表达水平，Caspase-3活性。结果：雄黄经高能球磨机球磨10〜50h,扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察，电镜测量纳米雄黄的平均粒径为(72.72±22.18)nm,符合纳米颗粒的形貌特征。纳米雄黄对K562细胞有明显的增殖抑制
2、作用。24,48,72h的IC50分别为43.48,20.52,16.07mg•L-lo20,50mg•L-1纳米雄黄作用48h后AnnexinV/PI染色显示凋亡细胞明显增高，凋亡率分别为10.52%,73.25%o纳米雄黄作用48h后Bax蛋白表达由对照的(75.80±2.40)%升高至U(87.50±1.20)%和(99.60±0.10)%；Bcl-2蛋白表达由对照的(73.85±0.15)%升高到(94.80±2.00)%和(97.75±0.55)%。20,50mg•L-1纳米雄黄处理K562细胞24h后，K562细胞Caspase-3蛋白表达水平由对照的(3.14土0.2
3、4)%升高到(8.87±2.74)%和(72.55±1.45)%；细胞的BCRP,P-gp蛋白，P53蛋白表达总体呈上升趋势，共表达也呈上升趋势。结论：纳米雄黄可以显著诱导白血病药物敏感K562细胞发生凋亡。［关键词］纳米雄黄；白血病；细胞凋亡白血病（leukemia）是起源于造血干细胞的疾病，该病在青壮年恶性疾病中居于首位［1］。雄黄是中医内治外用常用药之一，最早收载于《神农本草经》，现代药理学研究表明雄黄具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用［2］。雄黄的主要化学成分是As4S4或As2S2o由于雄黄本身是极其难溶于水的,所以雄黄在用于研究之前必须要制备成纳米级的颗粒，现代药理学研究证明
4、纳米级雄黄的药效要优于非纳米级别的雄黄，毒副作用也要较小，此外，纳米雄黄的吸收与传统雄黄比较其药代动力学发生显著的变化，吸收相增大而消除相减小［3］。纳米雄黄抗肿瘤作用机制复杂而广泛，研究表明纳米雄黄主要是通过抑制细胞生长、诱导细胞凋亡、促进肿瘤细胞成熟、分化、诱导细胞部分分化、抑制肿瘤血管生成及直接杀瘤作用起抗肿瘤作用［4］。纳米雄黄通过上述方式对白血病细胞起到凋亡诱导作用和直接杀伤作用。1材料与方法1.1材料RPMI1640（美国Gibco公司）；新生小牛血清（兰州荣晔生物科技有限责任公司）；PEcy5标记的鼠抗人CD34抗体、ECD标记的鼠抗人CD38抗体购自Caltag公司
5、；PE标记的鼠抗人CD123抗体购自eBioscience公司；PE标记的鼠抗人IgGl,ECD标记的鼠抗人IgGl和PEcy5标记的鼠抗人IgGl为Caltag公司产品；FITC标记的BCRP购自Biovision公司；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒购自eBioscience公司；FITC标记的鼠抗人Bcl-2单抗（美国Caltag）；PE标记的鼠抗人Bax单抗（美国eBioscience）；FITC标记的DEVD-FMK为Biovision公司产品；抗P-53单抗,FITC标记的羊抗鼠IgG购自Biovision公司；P-gp单抗（MRK16,KamiyaBiomedic
6、al公司），PE标记的羊抗鼠IgG2a（Caltag公司）。雄黄原药购自西安中药集团公司。1.2纳米雄黄制备传统雄黄粉末按照药典2000年版检验合格。采用行星式高能球磨机（QM-3SP2型，南京大学仪器厂）球磨法制备，转速400r•min-E球料比40：1、助磨剂为水，球磨10〜50h后经过水干获得。扫描电镜（JEM-6701F冷场发射型，日本电子公司）和透射电镜（JEM-1230型，日本电子公司）观察纳米雄黄的形态和粒径[5-6]o通过扫描电镜和透射电镜观察测定，制得纳米级雄黄粉体中100nm颗粒尺寸的粉末可达85%以上，其精细结构为20nm以下的细小晶粒和其周围的非晶体。制备物
7、自然阴干后收集。制得的纳米雄黄用KC1饱和硝酸溶液溶解，NaOH调pH至7.0,PBS定容，配成2g•L-1的储存液，过滤除菌，4°C保存备用。1.3靶细胞和细胞培养K562细胞由兰州大学医学实验中心保存。细胞接种于含15%新生牛血清(兰州荣晔生物科技有限责任公司)的RPMI1640培养液(美国GibcoBRL公司)中，置37°C,5%C02和全湿条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。1.4纳米雄黄对K562细胞增殖活性的影响将K562细胞(IX105个/mL)接种于
