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时间:2019-03-01
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1、河北农业大学硕士学位论文稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立姓名:陈振师申请学位级别:硕士专业:临床兽医学指导教师:汪恩强;华荣虹20120527摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis,罐)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)露l起豹严藿的人畜共患传染病,JEV与西尼罗病毒(WestNilevirus,WNV)、圣路易脑炎病毒(Saint-Louisencephalitisvirus,SLEV)和墨累滗谷脑炎病毒(/'durrayValleyencephalitisvirus,MVE
2、V)忍羁一个血清群,其广泛分布于系亚和南噩。NSl蛋自俸为一种膜功能相关耱蛋愈,可能参与病毒的晕期复制、RNA复制或病毒组装和释放,是主要的抗原成分之~。NSl蛋囱不参与组成毒粒,因而没有中和活性和血凝抑制活性,但它共有可溶性补体结合活性,可在不出现中和抗体的情嚣下诱生保护力,这种保护作用依赖于抗体的&片段。到麓翁势止,研究人爱对NSl蛋鑫的俸用撬制尚不十分清楚,这就要求对其结构、功麓及特性进行深入的研究。然丽,原核细胞表达的NSi蛋白不能彤成原有的分子构象,给研究带来局限性,因此需要建立麓稳定表达J嚣VNSl蛋囊的真核细胞系。本研究将乙型脑炎病毒SA
3、l4,董4屹株鲶NSl基因密码予优化舞,进行人王合成。将NSl基因亚炎隆至真核表达载体pCAGneo审并构建重组震粒,对其进行酶切鉴定和测序,该重组质粒为溺性,命名为pCAGneo。opti.JEV-NSl。将该阳性重组质粒转纯DH5ct感受态细胞,挑取单菌落并扩大培养,在无菌条件下提取质粒。将提取的质粒线性化爝调整至合适浓度,转染RK-13细胞,经过(3418加压培养,以有限稀释法筛选出一株稳定表达NSl蛋白的缨胞系。该细胞系经过RT-PCR、western-blot、IFA、免疫组化等方法鉴定,诞实NSI蛋囊在细胞内爵获褥稳定表达。本研究为深入探讨
4、NSl蛋自作用机制提供了可能性,为研究JEV的致病枫理和免疫枫铡奠定了基础。目前l瞄床上传统的疆诊断方法有一定局限性,如溺来检测JEV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)是建立在抗体和抗原褶结合的基础上,爵能导致非特异性反应,进丽霹麓导致特异性抗体缀难被检寓或凌现假阳性结果。本研究以上述细臆系为靶细胞,通过朴体介导的缨胞毒镶试验(CDC)成功建立了一种毅型豹检测抗NSl矮自抗体的方法。该方法有较离的灵敏度、特异度翻敏感性,具有比ELISA方法更好的准确度。由于露前广泛疲用的灭活疫苗不能诱导机体产生抗NSI蛋巍的抗体,因丽该方法也为区别盎然感染和人工免疫
5、提供了理想手段,对J料的流行病学研究其有重要意义。关键词;乙型脑炎病毒;NSl蛋白;细胞系;孝}体介导的细腿毒性试验EstablishmentofstablyexpressingNSlproteincelllineofJapaneseencephalitisvirusMastercandidate:ChenZhenshiAdvisor:.Prof.WangEnqiangMajor.ClinicalVeterinaryMedicineAbstractJapaneseencephalitis(JE)isaseriouszoonosiscausedbyJap
6、aneseencephalitisvirus(JEV)。砀eJapaneseencephalitisvirusserocomplexofthefamilyFlaviviridaeincludesWestNilevirus(WNV),SaintLouisencephalitisvirus(SLEV)andMurrayValleyencephalitisvirus(MWV).JEVwidelydistributesinEastandSouthAsia.Asamembrane-associatedglycoprotein,NS1proteinisoneoft
7、hemajorcomponentsoftheantigen,itisinvolvedinviralearlyreplication,RNAreplicationandassembly,andreleaseofthevirus.NS1proteincannotbepartofvirusparticles,SOitshowsnoactivityinneutralizingandhemagglutinationinhibition.Additionally,foritsbindingactivityforsolublecomplements,itCanind
8、uceprotectiveimmunitywithoutneutralizationantib
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