实验性自身免疫性重症肌无力大鼠外周血淋巴细胞microrna表达谱研究

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1、徐州医学院硕士学位论文实验性自身免疫性重症肌无力大鼠外周血淋巴细胞microRNA表达谱研究姓名：王娇申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：沈霞2012-04徐州医学院硕士学位论文实验性自身免疫性重症肌无力大鼠外周血淋巴细胞microRNA表达谱研究★中文摘要目的探讨微小RNA(microRNA)在实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠外周血淋巴细胞中的特异性表达，并进一步作microRNA靶基因预测。方法1．12只雌性Lewis大鼠，SPF级，6．8周，体重150．1809，随机分组为EAMG组8只和对照组4只。EAMG模型的建立：首先制备抗

2、原乳剂，具体流程如下：以生理盐水(normalsodium，NS)溶解大鼠AchR97．116肽段，再与卡介苗(结核分枝杆菌菌株H37Ra)及完全弗氏佐齐IJ(CFA)充分混匀成乳剂(其中AchR97-116肽段浓度为50I，tg／2009l，卡介苗浓度为lmg／m1)。免疫部位：双后肢足掌皮下。对照组：只接受等量完全弗氏佐剂(CFA)与生理盐水(NS)混合乳剂，于双后肢足掌皮下免疫。免疫部位：双后肢足掌皮下。对照组：只接受等量完全弗氏佐齐t](CFA)与生理盐水(NS)N合乳剂，于双后肢足掌皮下免疫。依照Lennon评分标准‘¨，利用双盲法对两组鼠每

3、天进行体重测量和行为学观察。2．当EAMG组大鼠临床评分达到2分时进行实验研究，分别对EAMG组和对照组大鼠进行颈动脉采血，密度梯度离心法(Ficoll法)分离外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells，PBMCs)。采用microRNA基因芯片和定量PCR技术分析并验证EAMG大鼠PBMCs的microRNA表达谱。3．构建第二批EAMG组和对照组模型后，分离出PBMCs，并进一步经MACS负性分选CD4+T细胞，流式细胞仪检测CD4+T细胞分选纯度(当CD4+T细胞分选纯度>90％时，符合进一步实验标准)。根据芯

4、片分析结果，选取兴趣microRNA，应用实时荧光定量PCR(Quantitativereal—timePCR，Q—PCR)技术分析CD4+T细胞兴趣microRNA表达。4．运用生物信息学预测兴趣microRNA的靶基因并用荧光素酶实验验证。结果1．EAMG模型组大鼠免疫后出现两个发病时相，分别丌始于免疫后第1徐州医学院硕士学位论文天、第28天左右，并分别于第7天和第56天达到发病高峰，且仅极少数发生死亡。早期发病时相疾病严重程度较轻微，低于1分(Lennon评分标准)，属于一过性发病且维持时间短暂，在此期间伴随着体重的轻度下降；晚期发病时相开始于第

5、1次免疫后49天，并逐渐加重，表现为消瘦、震颤、活动无力、撕咬无力、弓背低头垂尾姿势、甚至全身衰竭等。CFA大鼠免疫则未出现明显的上述症状。发病第7天EAMG组(159．O±2．5)g，对照组为(158．8+3．8)g(P>O．05)，两组大鼠体重比较差异无统计学意义p0．05)。发病第56天EAMG组(150．O±4．5)g，对照组为(210．8-t-4．4)g，两组大鼠体重比较差异有统计学意义(户<0．05)。2．microRNA基因芯片结果显示：11个microRNAs在EAMG组中表达差异显著，有统计学意义(P

6、iRNAs(miR．24、miR-151、miR．423、miR．181c、miR．145、miR．326、miR-143和miR-328a)表达下调，3个miRNAs(miR-101a、miR-193和miR-33)表达上调。3．Q．PCR检测EAMG组和对照组大鼠淋外周血巴细胞和CD4+T细胞miR．145表达，结果显示miR0145在EAMG大鼠外周血淋巴细胞表达明显降低妒<0．05)，而在CD4+T细胞则显著降低(P<0．01)。4．生物信息学分析显示并经荧光素酶实验证实：T细胞激活所需的重要共刺激分子CD28是miR．145的下游靶基因。结论

7、在EAMG外周血淋巴细胞中microRNA存在异常表达，提示microRNA在EAMG发病机制中发挥重要作用。同时我们利用生物信息学发现，CD28分子是miR．145的一个新的靶基因。在EAMG中，miR一145表达下调可能使其抑制CD28的作用减弱，进而促进T细胞的异常活化。miR-145可能作为一个潜在的治疗靶点，对治疗人类MG具有重大的意义。关键词miR．145；EAMG；CD4+T细胞；T细胞活化；CD28徐州医学院硕士学位论文MicroRNAprofileinperipheralbloodmononuclearcells●一‘一‘’‘inth

8、eratswithexoerimentalautoimmunemyastheniagravis