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《实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑calpainⅰ表》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑CalpainⅠ表【摘要】目的通过观察动物模型脑的钙蛋白酶(Calpain)Ⅰ表达的变化,探讨急性播散性脑脊髓炎的发病机制。方法①利用雌性ethod1.ToestablishEAEmodelusingfemale)是以中枢神经系统(centralnevoussystem,S)白质的急性炎症性脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病,确切病因及发病机制迄今不明[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与人的ADEM临床、生化、免疫及病理等诸方面具有相同或相似的特征,目前已被国内外公认是研究ADEM的理想的动物模型[2]。2006-0
2、6~2008-02本科应用急性EAE模型动态观察EAE发病过程中不同时期的CalpainⅠ表达的变化,旨在探讨EAE发病的病理生理,为临床治疗ADEM提供理论基础,为Calpain抑制剂的应用时机、治疗持续时间等提供理论依据。 1材料与方法 1.1一般资料 1.1材料 1.1.1实验动物 健康a公司;百日咳疫苗原液(BPV):购自北京生物制品研究所。②兔抗大鼠CalpainⅠ多克隆抗体,购于Abcam公司;Sp试剂盒和DAB显色盒均购于福建迈新公司。③多聚赖氨酸溶液:Sigma公司进口分装。用时蒸馏水1∶10稀释。 1.2方法 1.2.1
3、完全抗原制备(EAE模型的抗原制备) 取10只豚鼠称重后,按脑脊髓重量1g加生理盐水1mL的比例,冰浴中匀浆,再将匀浆液与等体积的完全福氏佐剂(CFA)充分混合,以无菌注射器及反复抽打制成油包水乳剂,作为抗原,4℃保存,12h内用完。 1.2.2EAE模型制备 取20只L/kg腹腔注射麻醉,无菌状态下以百日咳疫苗原液0.1mL/只(含2×1010个菌体)左后足背注射,以完全福氏佐剂(CFA)与豚鼠脑脊髓匀浆(GPSCH)混合液0.4mL/只四足垫注射。其中8只注射后7d做脑组织标本取材,为免疫后7d组。 1.2.3EAE模型神经功能评分 0级
4、:不发病;1级:尾部张力降低或轻度步态笨拙,双后肢轻度拖动;2级:尾部无张力,或中度步态笨拙,双后肢中度无力,明显拖动或姿态维持缺乏;3级:双后肢重度无力,但尚能拖动,肢体无力;4级:双后肢或四肢肢体瘫痪和尿便失禁;5级:濒死状态。 1.2.4实验动物分组及给药 从正常对照组中取8只;免疫后7d未发病组8只;72只中53只造模成功,选择功能评分2~4级的EAE大鼠32只,随机分4组:发病后3、7、14、21d组。 1.2.5脑组织标本采集、组织固定及石蜡切片。 1.2.6HE染色及脑内calpainⅠ免疫组化检测(Sp法)。 1.3图像采集与
5、统计学分析 各组每个时间点取8只大鼠,连续冠状切片,在相近层面(包括纹状体、额顶叶皮质、海马、侧脑室SVZ和室管膜等脑区)选取5张切片,每张切片在上述部位均选取同倍(×400)的3个不同视野,采用图像分析系统计算每个视野的免疫阳性细胞数(CalpainⅠ细胞),所有数据以均数±标准差(x±s)表示,数据统计采用spss12.0forwindows软件系统处理,采用单因素方差分析,α=0.05为检验水准,P<0.05差异有统计学意义。 2结果 2.1EAE模型制作鉴定 2.1.1EAE动物模型的行为学表现 实验组大鼠免疫后第12d出现首例发病,
6、随后陆续发病,潜伏期为(14.21±2.126)d,发病前大鼠出现体重突然下降、皮毛不光滑、食欲不振等表现,发病多以双后肢步态笨拙、活动不灵活为首发症状,后逐渐加重,出现双后肢瘫痪。发病后3~5d临床症状达高峰并持续2d左右,随后症状逐渐缓解。实验组患病率为73.6%(53/72)。对照组体重增加正常,观察到第28d均未出现EAE临床表现。 2.1.2HE染色结果 光镜下可见EAE组大鼠脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,血管内皮细胞增生、肿胀、破坏,胶质细胞增生,炎性细胞聚集在血管周围呈典型的“袖套”样改变;脑膜和脊膜也有炎性细胞浸
7、润。对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。 2.2EAE时鼠脑的脑CalpainⅠ的变化 CalpainI阳性细胞存在于胞浆中,染色成棕黄色。正常对照组大鼠脑组织中可见的CalpainI阳性细胞极少。在给予豚鼠脊髓匀浆免疫后CalpainI阳性细胞逐渐增多,在发病后7d达高峰,且染色反应增强,然后逐渐下降,21d仍高于正常,与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05);正常对照组CalpainI阳性细胞数与免疫后7d、发病后3、7、14、21d相比均有统计学意义(P<0.05);发病后7d组与其它各组相比均有统计学意义(P<0.05)。见
8、表1。表1各组鼠脑的脑CalpainI阳性细胞数比较(略)注:*P<0.05与正常对照组
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