人肠道病毒71型感染星形胶质细胞的特性及感染相关的磷酸酶研究

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1、博士学位论文学校代码：10023学号：B2009436人肠道病毒71型感染星形胶质细胞的特性及感染相关的磷酸酶研究lnvitroCharaCterizatiOnofhumanenteroviruS71infectionofrhesusmonkeyastrocytesandthephosphatasesplaycrucialroleinenterovirus71●，●■InteCtIon所院：医学生物学研究所姓名：郭素杰指导教师：李琦涵研究员导师小组：刘龙丁研究员董承红副主任技师学科专业：免疫学研究方向：病毒免疫学完成日期：2012年5月目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5一、实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13二、结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一28三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一53四、小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一67参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯一68文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一77附录一主要缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85附录二主要溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87附录三恒河猴磷酸酶库基因列表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯90致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯100研究生简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101北京协和医学院博士研究生学位论文摘要小RNA病毒科肠道病毒属成员人肠道病毒71型(Humanenterovir

4、us71，HEV71)是手足口病的常见病原体。近年来，HEV71感染为主的手足口病在东亚、东南亚国家和地区造成数次大规模流行。在中国大陆，自2008年以来，HEV71成为手足口病大规模流行的主要病原体，严重病例可引起神经系统感染导致呼吸、循环功能障碍而致婴幼儿死亡。因而HEV7l流行成为严重的公共卫生问题。该病毒被认为是脊髓灰质炎病毒消灭后最重要的嗜神经性肠道病毒。深入研究该病毒的嗜神经机制进而探索有效的防治措施具有现实迫切性。本课题组前期工作发现，HEV71可有效感染恒河猴婴猴，因而可以作为HEV71感染研究的模式动物。本研究我们将重点集中于比神经元数量更多的星形神经胶质细胞，

5、此细胞在整个中枢神经系统中参与多种功能。在建立恒河猴星形神经胶质细胞培养体系的基础上，应用2008年分离自安徽阜阳一例重症手足口病患者的C4亚型HEV71毒株HEV71-FY23研究了HEV71感染星形神经胶质细胞的特点。随后利用RNA干扰文库筛选方法筛选了与该病毒感染星形神经胶质细胞过程相关的磷酸酶基因。并对筛选结果进行了初步探讨。首先，对建立的原代培养体系利用消化法和差速粘附法相结合的方法纯化星形神经胶质细胞，经免疫荧光鉴定星形神经胶质细胞纯度大于95％。然后，研究了HEV71．FY23感染星形神经胶质细胞的特点。发现FY23感染星形神经胶质细胞可出现典型的细胞病变效应，以感

6、染复数(M．O．I)=O．4感染后6．8h病毒滴度可达峰值；透射电镜下，感染后形成的二十面体病毒颗粒清晰、完整；感染的星形神经胶质细胞细胞浆可观察到类似脊髓灰质炎感染的膜状结构；病毒在细胞内复制形成晶格状结构。对磷酸酶siRNA文库进行筛选并反复验证，在213个基因中，未发现明显起作用的干扰后使病毒滴度上调的磷酸酶基因。发现11个干扰后使病毒滴度下调的磷酸酶基因。这些基因编码产物主要归类为酪氨酸特异性磷酸酶(5个)，双特异磷酸酶(4个)，丝氨酸／苏氨酸特异性磷酸酶(2个)。这些基因参与多种生物学过程。进一步应用酪氨酸磷酸酶抑制剂、丝／苏氨酸磷酸酶抑制剂发现，这些磷酸酶可以对HEV

7、71的复制和增殖产生影响。选取两个基因进行过表达实验发现磷酸酶基因过表达时病毒滴度有一定程度上调。综合以上实验结果，说明HEV71感染星形神经胶质细胞是HEV71在神经系统感染、扩散的重要步骤。推测HEV71感染后，在星形神经胶质细胞、免疫系统、小胶质细胞等参与下与神经元发生了多种方式、多种途径的复杂相互作用，从而导致中枢神经系统发生广泛的炎症反应和病变。在HEV71感染星形神经胶质细胞过程中，有多种磷酸酶参与病毒复制、增殖；这些磷酸酶与中枢神经系统发生广泛相北京协和医学院博士研