病毒vdcv1的rna沉默抑制子研究

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1、密级★保密期限：（涉密论文须标注）ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究英文论文题目：ThestudyonthesuppressorofRNASilencingfromVdCV1学科专业：生物化学与分子生物学作者姓名：柳燕导师姓名：竺锡武研究员递交日期：2014年6月万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究作者姓名柳燕学科(专业)生物化学与分子生物

2、学指导老师竺锡武研究员所在学院生命科学学院提交日期2014年6月中国杭州万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究ZHEJIANGSCI-TECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONThestudyonthesuppressorofRNASilencingfromVdCV1YanLiuDirectedbyDr.XiWuZhuProfessorCollegeofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversityJune.2014HANGZHOU,CHINA万方数

3、据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究分类号：密级：UDC：病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究论文答辩日期2014年6月6日答辩委员会席高永生论文评阅人廖乾生答辩委员会员胡秀芳刘小川杜志游廖乾生万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究课题来源国家自然科学基金项目（31071729）资助万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制

4、子研究摘要棉花黄萎菌病毒Verticilliumdahliaechrysovirus1（VdCV1）本实验室已经报道，但对该病毒功能及其基因功能尚未做实验研究。VdCV1是否具有沉默抑制子尚未有研究报道。探明VdCV1是否具有沉默抑制子对于探明病毒VdCV1的作用机制具有重要意义。本实验将对VdCV1所含的4个基因编码的蛋白能否抑制植物的RNA沉默进行探索。本研究首先以植物表达载体PH7WG2D为基本骨架，通过Gateway技术的BP反应构建入门载体，入门载体与PH7WG2D改造后的表达载体pJC31通过LR反应构建表达载体。本实验

5、通过这种方法成功构建了表达RdRP蛋白，CP蛋白及OTU蛋白的植物表达载体pJCH-VcR1ORF，pJCH-VcR2ORF，pJCD-VcR4ORF，经酶切鉴定、PCR鉴定和测序分析表明载体构建成功另外，通过酶切连接法，成功构建了未知功能蛋白表达载体pCB301-VCR3ORF。采用农杆菌瞬时表达法沉默抑制实验，将pJCH-VcR1ORF、pJCH-VcR2ORF、pJCD-VcR4ORF、pCB301-VCR2ORF质粒农杆菌分别于pBIGFP农杆菌共浸润注射接种本生烟或转基因本生烟植株16C，并以质粒农杆菌PJCH-CM、pC

6、B301处理为阴性对照。实验中紫外灯下绿色荧光观察结果显示：VcR1、VcR2基因处理组在第3、4天时比阴性对照组的绿色荧光强，第5天荧光差异明显减小；p19阳性对照组的荧光亮度全过程比VcR1、VcR2基因处理组的荧光亮度强且持续稳定。Westernblot分析GFP蛋白表达的时序过程，结果显示：在第3、4天，VcR1、VcR2基因处理组比阴性对照组GFP蛋白表达量大，第5天GFP表达量差异明显减小。Northernblot分析目的基因表达时序过程，结果显示：VcR1、VcR2基因在植物中瞬时表达量在第3、4天表达量相对较大，第5

7、天明显减少。因此综合分析认为VdCV1的VcR1基因编码的RdRP蛋白和VcR2基因编码的CP蛋白可能是植物RNA沉默的2个弱的抑制子。经多次重复实验，紫外灯下绿色荧光观察，VcR4处理组与VcR3处组的荧光在实验的第3至7天与对照没有差异，因此确认VdCV1的VcR4编码的OTU蛋白和VcR3编码的未知功能蛋白在烟草中不能抑制基因沉默。关键词：RdRP蛋白；CP蛋白；OTU蛋白；VcR3基因；沉默抑制子I万方数据浙江理工大学硕士学位论文病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究AbstractTheVerticilliumdahliae

8、chrysovirus1(VdCV1)hasbeenreportedbyourlaboratory,buttheviralgenefunctionhasbeennotstudied.WhetherthegeneofVdCV1could