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《铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生muc5ac分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC分子机制［摘要］目的探讨铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)诱导气道上皮细胞表达产生粘蛋白MUC5AC的影响，并探讨其可能的分子机制。方法体外培养NCI-H292细胞，用Pa感染后,采用ELISA检测MUC5AC的产生情况；并用商品化的MMP-9活性检测试剂盒检测其产生以及酶活性情况。同时,采用EGFR,PI3K,NADPH,ROS和MMP特异性抑制剂AG1478,LY294002,DPI,NAC和GM6001预处理NCI-H292细胞，观察MUC5AC以及MMP-9的产生
2、情况。结果Pa能以时间依赖性方式诱导NCI-H292细胞产生MMP-9,并增加其活性。EGFR活化后，经PI3K途径激活Rael并诱导MMP-9的表达，最终诱导MUC5AC产生。结论Pa经EGFR/P13K/Rac1/NADPH/R0S/MMP-9通路诱导NCI-H292细胞产生MUCSACo［关键词］铜绿假单胞菌；基质金属蛋白酶-9；MUC5AC［中图分类号］R562.22［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2013)29-0001-03慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COP
3、D)是世界上第四位的主要死亡原因［1］。对于某些患者而言，呼吸道粘液过度分泌是导致C0PD急性发作的重要特征［2］。作为机体抵御外来病原体感染的重要保护屏障，粘液是固有免疫系统的重要组成部分［2,3］。但病理条件下引起的粘蛋白过度表达往往会导致呼吸受限或换气不足［2,4］。在已经鉴定出的20多种粘蛋白中，以凝胶粘蛋白MUC5AC研究最多［5］。研究表明，MUC5AC在肺部表达较高，多种细菌性刺激均可上调其分泌。本研究旨在探讨铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)诱导人气道上皮细胞NCI-H292产生MMP-9的分子机制
4、，并探讨其在诱导产生MUC5AC中的作用。1材料与方法1.1试剂与菌株鼠抗人MUC5AC单克隆抗体购自SigmaoHRP标记羊抗鼠多克隆抗体购自SantaCruz。CM-H2DCFDA为MolecularProbes产品，NSC23766购自Tocris0特异性抑制剂AG1478(EGFR),LY294002(PI3K)、DPI(NADPH),NAC(ROS),GM6001(MMP)购自Sigma0Pa和NCI-H292细胞株购自ATCCo胎牛血清、RPMI1640为Gibco公司产品。1.2Pa培养挑取PA单菌落，在LB液体培养基中37*下震
5、荡培养3h,取200UL菌液接种至LB琼脂平板，371过夜培养。PBS洗脱平板上细菌并收集到Eppendorf管中，10000rpm离心10min,PBS洗涤沉淀2次。分光光度计测定菌液0D值(650nm）并计算细菌的浓度。1.3NCI-H292细胞培养人气道上皮细胞系NCI-H292细胞用含10%FBS、100U/mL青霉素及100ug/mL链霉素的RPMI-1640培养基中于5%C0237£的环境下生长。实验前，将细胞按密度为5X105/孔接种于6孔板中。Pa刺激前，细胞于无血清条件下培养24h,加入培养的Pa共感染9h。在研究抑制剂效应时
6、，NCI-H292细胞预先用相应的抑制剂刺激1h,随后再用Pa感染。本研究当中所用的抑制剂浓度分别为：10UMAG1478、20uMGM6001.50UMNSC23766、50uMLY294002.15uMDPI和30mMNACo1.4明胶酶谱实验细胞用无血清培养基培养24h后，收集上清，加入Laemmli样品缓冲液并经含1mg/mL明胶的SDS-PAGE（分离胶10%）o电泳结束后,加入含2.5%Triton-X-100复性液孵育30min以去除SDS。随后将凝胶用50mmol/LHCKpH7.4）,5mmol/LCaC12和1nmol/LZ
7、nC12于37°C下孵育过夜。加入0.05%考马斯亮蓝R-250室温染色30min,去离子水脱色，拍照，灰度扫描。1.5Rael活性检测裂解处理后的NCI-H292细胞，根据Cytoskeleton公司生产的G-LISATMActivationAssay试剂盒的操作说明测量Rael的活性。本试剂盒采用ELISA原理测量小G蛋白中结合GTP（活性形式）的含量而加以确定。测量组荧光强度/对照组强度的比值即为Rael的相对活性。1.6ROS检测NCI-H292细胞刺激结束后，加入10UMCM-H2DCFDA用于检测自由基的活性。荧光强度采用荧光分光光
8、度计（HitachiF-2000）进行分析，其中激发波长为488nm,发射波长为530nmoROS含量根据标本荧光强度/对照品荧光强度的比值表示。1.
