姜黄素对铜绿假单胞菌诱导人肺上皮细胞产生细胞因子影响和其分子机制探究

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1、姜黄素对铜绿假单胞菌诱导人肺上皮细胞产生细胞因子影响和其分子机制探究　　南华大学附属第三医院感染科，湖南衡阳421000[摘要]目的探讨姜黄素对铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa，Pa）感染的肺上皮细胞的体外抗炎效应。方法体外培养肺上皮细胞系NCI-H292，加入姜黄素和培养的Pa感染不同时间。Westernblot检测和实时定量PCR分别检测NCI-H292细胞中红素氧合酶1（Hemeoxygenase-1，HO-1）mRNA和蛋白表达情况；ELISA检测IL-1β和IL-8的产生。同时采用RNA干扰HO-1表达后，观察对Pa诱导IL

2、-1β和IL-8产生的影响。结果Pa感染NCI-H292细胞后，IL-1β和IL-8含量分别为（87.52±7.96）pg/mL和（205.63±34.25）pg/mL，50μg/mL姜黄素孵育8h后，其含量分别降至（15.78±10.74）pg/mL和（49.82±14.28）pg/mL，处理前后差异有统计学意义（P　　[基金项目]湖南省衡阳市科学技术发展计划项目（编号2012KJ28）。血红素氧合酶（Hemeoxygenase-1，HO-1）是催化血红素降解为CO、Fe2+和胆红素的限速酶，并在机体的抗炎症、抗氧化损伤中发挥重要作用[1]。研究显示，铜绿

3、假单胞菌（pseudomonas7aeruginosa，Pa）感染后，肺上皮细胞可反馈性表达HO-1从而在一定程度上对抗Pa感染所诱导的氧化应激损伤[2-3]。因此，以HO-1为出发点，寻求相应的诱导剂，可能对Pa感染所导致的肺黏膜损伤具有重要意义。姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种植物多酚，大量研究证明，姜黄素具抗氧化、抗炎、清除自由基、抗肿瘤、抗炎症以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用[4-5]。本研究旨在探讨姜黄素对肺上皮细胞表达HO-1的影响，并观察其是否能抑制Pa感染所诱导的细胞因子产生。1材料与方法1.1主要试剂

4、姜黄素购自Sigma公司。SYBGREENPCRMix购自ABI，TRIZol为Invitrogen产品。cDNA逆转录试剂盒购自Fermentas；RIPA裂解液、ECL试剂盒为Pierce产品；IL-1β和IL-8ELISA购自深圳博盛生物科技有限公司。BCA试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司，HO-1和β-actin多克隆抗体购自SantaCruz。RPMI1640培养基和胎牛血清购自Gibco。1.2细胞和Pa菌培养人肺上皮NCI-H292细胞细胞系购自中科院上海细胞库，细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃5%CO2环境中培养。获取

5、Pa单菌落，接种于LB液体培养基，37℃培养3h。随后取2007μL菌液接种至LB琼脂平板中，37℃条件下过夜培养。洗脱并收集平板上细菌，10000r/min条件下离心5min，随后用无菌PBS洗涤2次。采用分光光度计于650nm波长下测定菌液OD值并计算细菌的浓度。1.3Pa感染和姜黄素处理NCI-H292细胞铺于96孔板（1×106/mL，0.1mL），24孔板（1×106/mL，1mL），或者6孔板（1×106/mL，2mL），培养48h，当其达到80%汇合度后，用无菌PBS漂洗，当细胞生长成片生长时，加入培养的Pa（1×109cfu/mL）以及不同浓

6、度（10、30μg/mL和50μg/mL）的姜黄素处理并继续培养24h。1.4实时定量PCR检测HO-1mRNA的表达细胞处理结束后，根据试剂盒操作说明提取总RNA并逆转录为cDNA，产物用RNA酶处理。设计特异性引物用于检测HO-1mRNA表达的定量。HO-1其正向引物：5′-GCTCAAAAAGATTGCCCAGA-3′；反向引物：5′-GCGGTAGAGCTGCTTGAACT-3′。50μL反应体系包括：25μL2×SYBRGreenMasterMix（200nmol/LdATP、dGTP和dCTP；400nmol/LdUTP；2mmol/LMgCl2

7、，0.25UUNG，0.625UAmpliTaqGoldDNA聚合酶，25pmol正向和反向引物，2μLcDNA。利用ABIPrism5700仪对HO-1进行扩增。首先50℃2min，95℃10min。随后95℃15s；60℃变形、延伸607s，共40个循环。同时采用β-actin为内参。mRNA表达倍数改变采用2ΔCt表示，ΔCt=（Ct对照基因-Ctβ-acin）-（Ct待测基因-Ctβ-acin）。1.5Westernblot分析HO-1蛋白表达6孔板中细胞经PBS漂洗后，加入RIPA细胞裂解液裂解30min，4℃12000g离心15min，上清即为细

8、胞总蛋白。裂解液中的蛋白用Bradford试剂在分光