il-lβ在肺成纤维细胞表达icam-1中的作用研究

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1、河北医科大学硕士学位论文IL--lβ在肺成纤维细胞表达ICAM--1中的作用研究姓名：焦晓丹申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：袁雅冬201203中文摘要IL．1p在肺成纤维细胞表达ICAM一1中的作用研究摘要目的：本研究应用体外培养Wistar大鼠肺成纤维细胞，采用免疫细胞化学染色法测定细胞间黏附分子．1(intercellularadhesionmolecule．1，ICAM．1)在肺成纤维细胞上的表达部位、RT．PCR方法测定ICAM-1mRNA表达水平，观察不同浓度IL．1p在不同时间点对肺成纤维细胞表达IC√蝴．1mRNA的影响。方法：采用组

2、织切块法对大鼠胚肺成纤维细胞的培养：将Wister临产孕鼠行乙醚吸入麻醉后，立即取出Wister胎鼠，将胎鼠肺组织剪成lmmxlmmxlmm大小的小块，加入含20％胎牛血清的DMEM培养基，一周左右待细胞铺满瓶底后传代，用第5~6代形态、结构一致贴壁生长的肺成纤维细胞进行实验。将实验分为三大组：(1)对照组：只应用DMEM培养液培养肺成纤维细胞6h。(2)不同浓度的IL．1p组：①应用含IL．113(0．5ng／m1)的DMEM培养液培养肺成纤维细胞；②应用含IL．1p(5ng／m1)的DMEM培养液培养肺成纤维细胞；③应用含IL．1p(15ng／m1)的

3、DMEM培养液培养肺成纤维细胞。以上各组均培养6h。(3)同一浓度IL．1p不同时间组：应用同样浓度IL．113(15ng／m1)对肺成纤维细胞细胞进行不同时间(Oh、2h、4h、6h、12h、24h)的培养，分为对照组、2h组、4h组、6h组、12h组、24h组。用免疫细胞化学染色法观察ICAM．1在肺成纤维细胞上的表达部位，采用RT-PCR法测定肺成纤维细胞中ICAM．1mRNA表达水平。以上各组实验重复6次。结果：1成功培养Wistar胎鼠原代肺成纤维细胞：本实验通过应用组织切块法培养Wistar胎鼠肺成纤维细胞，培养5～10h后倒置显微镜下即观察到

4、圆形的细胞从组织块周围游走出来，经l周左右，这种圆形细胞逐渐变成椭圆、菱形，并成放射状，足变长，相邻细胞融合，互相连接，细胞核大而圆，明亮。经2~3次胰酶消化纯化后，遗留的组织块、红细胞、上皮细胞等逐中文摘要渐被清除，剩下形态、结构、生长状态一致的肺成纤维细胞(细胞形态～致，胞体丰满，胞质均匀，核仁清晰，可见核分裂相，生长状况良好)，为理想的肺成纤维细胞实验模型。2ICAM．1在肺成纤维细胞的表达部位正常肺成纤维细胞ICAM-1表达呈弱阳性，以胞膜为主，包浆偶有表达，胞核无表达；ICAM-1在肺成纤维细胞膜被染成棕黄色颗粒。IL．1p(15ng／mL)干预

5、后，其胞膜的阳性颗粒颜色明显变深、增多。3RT-PCR方法测定肺成纤维细胞ICAM．1mRNA表达水平的变化各实验组在234bp处均出现了特异性的ICAM．1mRNA条带，576bp处出现了内参Rat[3-actin的特异片段。ICAM．1mRNA电泳条带的光密度扫描显示，对照组ICAM．1mRNA有一定量的基础表达，但表达量甚低(O．1124-0．02)。在培养液中加入不同浓度IL．113(0．5ng／mL、5ng／mL、15ng／mL)培养6h后，ICAM-lmRNA的表达量分别为0．3684-0．02、O．736：t：0．03、0．805+0．02，

6、与对照组相比均明显升高(P<0．01)，并且ICAM．1mRNA的表达水平随着IL．1D浓度的增加而逐渐升高，IL．1D不同浓度组之间比较差异有统计学意义(P<0．01)。同一浓度IL．113(15ng／mL)刺激下，对照组、2h组、4h组、6h组、12h组、24h组IC』蝴．1mRNA的表达水平分别为0．137：t：0．013、0．466+0．01、0．6724-0．09、0．8724-0．03、0．678+0．021、0．502+0．07，结果显示尽管IL．1B的浓度相同但是刺激时间不同时，ICAM-1mRNA表达水平并不相同，表现为刺激2h后出现升高

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