兔肌腱周围滑膜干细胞的分离培养及成骨分化

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1、兔肌腱周围滑膜干细胞的分离培养及成骨分化计：学位论文：32页表格：O个插图：23幅李鹏指导教师：齐志明教授申请学位级别：硕士学位论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学专业名称：外科学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作

2、了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：盘签字日期：芝!兰年互月堑曰关于学位论文使用授权的说明《兔肌腱周围滑膜干细胞的分离培养及成骨分化》系本人在大连医科大学攻读淑硕士)学位期间在导师指导下完成的学位论文。本人及指导教师完全了解大连医科大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文加入：1。中国学术期刊(光盘版)电子杂志社一一《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》及CNKI相关数据库。2．中国科学技术信息研究所一一《中国学位论文全文数据库》3．国家图书

3、馆本人授权大连医科大学，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文，可以公布论文的全部或部分内容。论文作者签名：指导教师签名；签字日期：乏硇翘僻厶如目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)再lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一一⋯”⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯“3(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19三、文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯DIDDDDODIPaIP·LID⋯22(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32兔肌腱周围滑膜干细胞的分离培养及成骨分化硕士生姓名：

5、李鹏指导教师：齐志明教授专业名称：外科学摘要目的：作为细胞生物学及组织工程学中的核心，滑膜干细胞隶属于成体间充质干细胞范畴。目前滑膜干细胞研究来源多为膝关节或颞下颌关节等关节囊内层的滑膜组织。作为滑膜组织体内另一分布一肌腱周围滑膜，其组织结构、生物化学性质及功能与关节内滑膜均相似，有可能成为滑膜干细胞另一有效组织来源a本实验将分离兔肌腱周围滑膜细胞，探讨经培养纯化后，获得腱周滑膜来源的滑膜干细胞的可行性及方法。进一步实验研究其定向成骨分化的能力，探讨其应用于骨质疏松及肌腱病治疗的可能性。方法：耳缘静脉注射空气处死实验用新西兰大白兔(约3月龄，1．5Kg)。借助显微镜无

6、菌条件下暴露双侧跟腱，获取周围滑膜组织。剪碎后，Ⅱ型胶原酶初步消化约l小时，织块培养法获得细胞。低密度种植，获得生长良好单克隆集落，通过局部消化、自然传代法获取纯化后细胞。取生长良好P3，P4代细胞，接种子24孔板，通过细胞计数法测定描绘SMSCs生长曲线，并计算细胞群体倍增时间。流式细胞仪测定细胞生长周期，计算增值指数等。使用CD44．FITC，CD45．FITC，CD90一FITC标记抗体，流式细胞仪测定SMSCs表面CD44，CD45，CD90标记性抗原。取第3代待80％-90％融合后细胞，更换成骨诱导液，进行成骨定向诱导分化，每天动态观察细胞生长形态变化，分别

7、于培养10天后进行非特异性碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色，3周后行VonKossa’S矿化结节染色做成骨鉴定。结果：1．成功获取跟腱腱鞘内层薄层清亮滑膜组织。采用II型胶原酶消化结合组织块培养法，可获得贴壁生长良好的细胞，传代后形态均～，成纤维细胞状，生长曲线为S形，平均群体倍增时间为42．5小时；细胞增殖稳定。流式细胞仪标记性抗原检测结果CD44、CD90阳性，CD45阴性，符合一般滑膜干细胞表面标记特点；2．更换培养液向成骨方向诱导后，可见细胞形态随时间渐改变，由原来扁平纤维状，逐渐呈立体改变，细胞代谢旺盛，细胞