p2x,7受体在少突胶质前体细胞的表达、功能效应及在缺氧缺血性脑损伤中作用的初步研究

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1、第三军医大学博士学位论文P2X<,7>受体在少突胶质前体细胞的表达、功能效应及在缺氧缺血性脑损伤中作用的初步研究姓名：王丽雁申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：蔡文琴20081101第三军医大学博士学位论文P2X7受体在少突胶质前体细胞的表达、功能效应及在缺氧缺血性脑损伤中作用的初步研究摘要围产期缺氧缺血(hypoxiaischemia，HI)是造成新生儿脑损伤的首要原因。尤其在早产儿形成一种区别于足月儿和成年人的独特病交⋯选择性脑白质损伤。病理改变包括脑室周围白质软化(periventricularleukomal

2、acia，PVL)和弥散性脑室周围白质损伤(periventricukwhitem砒eriIliury，PWMI)。后者发生率为前者10倍，以髓鞘减少或髓鞘形成延迟为主要病理特征。近年来，随着新生儿救护技术的提高，早产儿存活率显著增加，PWMI及由此产生的远期神经学后遗症发生率明显上升，给家庭和社会造成巨大负担。少突胶质前体细胞(oli90dendrocytepTecursorcells，OPCs)损伤是PWMI形成的主要原因和中心环节。未成熟脑白质中对缺氧缺血高度敏感的OPCs的大量死亡以及分化发育障碍是PWMI形成的关键

3、。因此，深入研究OPCs缺氧缺血性损伤机制，是阐明早产儿脑白质损伤机理，寻找预防和治疗药物，降低早产儿死亡率和致残率的重要途径。迄今为止，对OPCs缺氧缺血损伤机制所知有限，可能与谷氨酸兴奋毒性、炎症介质、氧化应激、细胞内Ca2+超载等多种因素有关。然而针对这些机制的干预措施并未转化为临床治疗成果。ATP是一种重要的神经递质，通过激活嘌呤能受体P2X和P2Y发挥多种作用。P2X7R是嘌呤能受体P2x家族中非常独特的一个亚类，为双功能受体，主要在病理条件下活化。现有的研究表明，P2X7R在胶质细胞具有广泛多样的效应，对病理状态

4、下多个信号通路具有关键的调节作用，提示P2X7R可能处于神经胶质信号过程中相当上游的调节位点，通过调节递质释放、炎症反应、细胞凋亡和增殖，在胶质变性及随后的修复过程中起重要作用。被认为是缺血再灌注损伤，Alzheimer’s病，脊髓损伤和神经性疼痛等疾病潜在的治疗靶点。对于P2X7R在神经胶质病理中的作用，至今还有许多未涉足的领域。新近报道P2X7R拮抗剂能改善疾病模型中的04+少突胶质细胞凋亡和脱髓鞘病变，提示P2x7R在少突胶质系细胞损伤过程中可能具有重要作用。然而目前对于P2X7R与OPCs的关系尚所知甚少。在预实验中

5、我们发现，离体培养的OPCs呈P2X7R免疫阳性。那么，OPCs表达的P2X7R是否具有功能?受体活化产生什么样的生物学效应?是否参与OPCs缺7第三军医大学博士学位论文氧缺血性损害或防御过程?为解决这些问题，首先，我们在原代纯培养的OPCs上检测P2X7R表达和功能效应；其次，观测氧葡萄糖剥夺后P2X7R在OPCs表达的变化以及激动剂、拮抗剂对OPCs缺氧缺血性损伤的干预效应；第三，为在更完整的系统中了解受体表达，建立P3大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，观察P2X7R在正常未成熟脑组织不同脑区的表达及HI后的变化。得出如下结果：

6、一、少突胶质前体细胞的培养和鉴定1．混合胶质细胞的培养采用机械分离法；以振荡分离法和差速贴壁法分离纯化OPCs；加入促进神经细胞存活的营养因子N2及促进增殖的细胞因子PDGFa和bFGF，获得数量较多的OPCs，通过NG2鉴定，培养细胞纯度在90％以上，并且具有向成熟少突胶质细胞分化的潜能。OPCs分离纯化的完成为以OPCs为研究对象的实验提供基础和保障。2．采用膜片钳技术证明OPCs具有独特电生理特性：输入阻抗(Ra)相对较高；电压依赖的K+电流具有外向整流特性；对TTX敏感的小的内向Na+流，不能产生动作电位。电生理特性

7、测定也是对OPCs进行鉴定的可靠方法之一。二、P2X，R在少突胶质前体细胞的表达以及受体活化后的功能效应1．通过ImPCR、Westemblot和免疫荧光双标技术，从基因和蛋白水平证明离体培养的OPCs表达P2X7R；2．100斗MBzATP诱导【c02+】i显著升高，药理学特性与P2x7R符合：用含EGTA的无钙溶液可以显著降低钙反应振幅，提示【Ca2+】i升高依赖于细胞外Ca2+，该效应由P2X受体介导；BzATP(100pM)诱导的钙信号平均振幅显著高于ATP(100pM)；100nMBBG预处理几乎完全抑制B栅诱导的

8、钙反应。说明在激动剂刺激下，P2X7R活化介导Ca2+内流，使得【Ca2+】i升高。3．染料负载实验中，300pMBZATP刺激，0PCs的荧光光密度较对照明显增加，300nMBBG预孵育可显著抑制此效应。提示高浓度B幽LTP诱导离体培养OPCs形成高通透性的质膜孔道，这一过程由P2X7R