资源描述：
《少突胶质前体细胞对脊髓伤治疗作用实验探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、少突胶质前体细胞对脊髓伤治疗作用实验探究摘要：采用Allen's重物撞击法建立小鼠SCI模型，致小鼠脊髓损伤。体外分离、培养和纯化GFP转基因鼠的OPCs。同时，对OPCs进行诱导分化。通过眶静脉将OPCs移植到脊髓损伤模型鼠体内。体外实验证明分离、培养并纯化的OPCs具有自我增殖的能力，并且可以分化为少突胶质细胞。移植后的OPCs不仅可以与宿主脊髓组织较好的整合，并可迁移到损伤部位，替代损伤组织。1.材料与方法.1.1材料主要试剂为DMEM/F12(1：1)培养基，bFGF、PDGF。胰蛋白酶、胎牛血清、胎盘蓝
2、染液、硫瑾染液、EDTA、多聚赖氨酸。抗体A2B5、04、Cy3、Alax488、DAPI和PI。C57BL/6小鼠，B6C3-Tg(EGFP)加强型绿色荧光蛋白转基因。1.2方法皮层混合细胞培养：在解剖显微镜下，取0〜2d新生的B6C3-Tg(EGFP)绿色荧光蛋白转基因小鼠，断头后迅速取出鼠脑，清除脑膜，分离双侧大脑皮质，置于预冷的D-Hanks液中漂洗2次，转入含无血清DMEM/F12培养液的离心管内,用巴氏吸管反复吹打至组织块基本消失，200目不锈钢筛网过滤，取滤液以1500rpm,离心5mino收集沉淀
3、，加入完全培养液(DMEM/F12、10%FBS.1%双抗)lml,用吸管吹打制成细胞悬液，计数后接种T-75培养瓶中，密度为2X105/mlo37°C5%C02条件下培养，以后每2〜3d换液1次。胚胎OPCs的分离和纯化：原代培养至9〜lid时，根据培养体系内星形胶质细胞融合及细胞分层情况进行振荡分离。振荡前，更换新鲜的基本培养基孵育24h,将培养瓶转移至恒温振荡器上进行初步振荡处理(220rpni,37°C,30min)o弃掉旧培养基，用无菌PBS清洗培养瓶3次，加入新鲜基础培养基8-10ml/瓶，转入培养箱
4、继续孵育lh,再次将培养瓶置于恒温振荡器上进行过夜振荡处理(300rpm,37°C,4〜6h)。收集振荡后细胞悬液并离心(1200rpm,4°C,10min)o用2〜3ml基本培养基重新悬浮细胞，将其接种于未包被多聚赖氨酸的培养皿内，入培养箱孵育20-30mino再取悬液并离心(1200rpm,4°C,5min)可去除大部分星形胶质细胞和成纤维细胞。用1〜加lOPCs培养基重新悬浮细胞，接种于包被多聚赖氨酸的培养瓶上，前两天进行1/3量换液。培养5d后，弃去培养基，加入少许DMEM/F12清洗1次，洗去细胞碎片；
5、加入0.25%的胰酶消化15〜20sec后立即加入血清终止消化，在倒置显微镜下观察，如仍有较多细胞贴壁可将培养瓶水平放置在脱色摇床上慢速摇晃1〜2rniri,吸取细胞悬液置于培养皿中，20min后收集细胞悬液并离心，弃上清液，用OPCs完全清培养基重悬细胞接种于多聚赖氨酸预处理的培养瓶中，转入细胞培养箱中继续培养。小鼠脊髓损伤模型建立及分组：根据Allen's等的重物撞击法建立SCI小鼠模型。成年C57BL/6小鼠32只，体重16〜18g,随机分为4组，即模型组、假手术组、细胞移植组和细胞液移植组，每组8只。模型
6、制作与Allen，s的方法基本一致，但略有变动。在261下，将麻醉后小鼠，俯卧于手术台上，根据棘突的体表定位确定手术切口后，将手术区域剪毛备皮处理，用碘伏、70%酒精彻底消毒皮肤。取背部正中切口，逐层切开皮肤、皮下组织、筋膜。沿棘突向两侧剥离棘旁肌，充分显露T8-T12棘突及相应椎板。咬除T9-T11棘突，切除T10全椎板,充分暴露相应脊髓节段。以5.0g,0.5mm/sec的致伤速率打击脊髓造成小鼠SCI。造模成功后逐层缝合切口。OPCs的移植：在模型制备后的第7天行细胞移植，其中细胞移植组给予OPCs移植治疗
7、，细胞液移植组给予培养基注射治疗，模型组和假手术组不做任何处理。细胞计数后将其浓度调整为5X106细胞/10uL/只。将小鼠麻醉、固定，右手持微量注射器，沿右眼或左眼眶下壁，以45。角刺入,刺入深度约2〜3mm，若遇阻力稍后退调整角度后再刺入，缓慢将细胞悬液推入眶后静脉丛。留针2分钟后缓慢拔针。行为学判定：实验采用常用Basso,BeattieandBresnahan(BBB)运动功能评分观察研究OPCs移植术后小鼠后肢运动功能的恢复情况。将小鼠后肢运动功能分为22(0-21)个等级，完全性瘫痪为0分，功能正常常
8、为21分。观察时将受试动物置于lm2的空旷、不滑的平面场地上，使其适应场地活动。然后连续观察4min自由活动。免疫细胞化学染色：分别将纯化后的OPCs用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定20分钟，进行A2E5免疫细胞化学检测。取材：分别于术后7d,14d和21d,先用生理盐水再用4%多聚甲醛进行心脏灌流固定，后取出脊髓组织，分别经15%及30%蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片，
