nf-κb和ap-1参与低氧诱导大鼠crhr1基因转录调节

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1、浙江大学博士学位论文NF--κB和AP--1参与低氧诱导大鼠CRHR1基因转录调节姓名：石艳军申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：杜继曾；陈学群20120323浙江大学博士学位论文摘要NF．KB和AP．1参与低氧诱导大鼠CRHRl基因转录调节浙江大学医学院：神经生物学博士研究生：石艳军导师：杜继曾教授陈学群教授摘要低氧应激是应激的重要形式之一．为适应低氧环境、进行自我保护，机体形成了在不同氧环境下的基因表达调控机制。促肾上腺皮质激素释放激素(Corticon-opiIlIre·leasingho舯one，CRH)家族在机体

2、低氧应激过程中通过调节下丘脑．垂体一肾上腺皮质(hypotllal锄uspi“t叫adrenal，HPA)轴、神经内分泌系统、自主神经系统和免疫系统功能，参与调节机体的低氧应激过程，进而稳定机体内环境。促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(CorticotropinreleaSiIlghomonerece讲orl，CImRl)介导CIm生理作用的发挥，其基因表达调控是应激诱导HPA轴反应的关键环节。我们实验室前期研究发现低氧应激激活HPA轴，诱导大鼠等动物脑不同部位以及腺垂体CI出RlmI冰A表达上调，提示低氧下转录因子可能通过与其作

3、用元件结合，在转录水平调控CImRlm砌蛆的表达。本研究旨在探讨低氧应激下NF．递和AP．1参与CImRl转录调节的机制。研究方法将大鼠垂体CRHRl基因5’调控区．2161一+347段不同长度DNA序列亚克隆入不含启动子的萤光素酶载体pGL3中，构建各种质粒，转染AtT20细胞，检测其活性与内参pRL．TK萤光素酶活性比值；利用整体间歇低氧应激动物模型，研究低氧诱导大鼠垂体cRHRl基因表达变化；应用EMsA方法检测转录因子在体外与靶序列结合活性；应用定量IkaltimePCR方法检测整体水平CRHRlmRNA的VII浙江大学博

4、士学位论文摘要表达．研究结果如下：1．获得大鼠垂体CIⅢRl基因5’调控区．216l一+347段DNA序列，全长为2508bp，经过生物信息学分析，发现该序列分别含有5个c-jun／AP．1，3个GR，4个NF．1出以及8个HIF．1结合位点。2．成功构建质粒p216l—18T和p216lLuc，分别用于测序和检测c融恹1基因5’端调控区转录活性。根据转录因子结合元件在CImRl基因5’调控区．2161～+347段的分布，又分别构建了p1833Luc、p1795Luc、p1692Luc、p1289Luc、p1248Luc，p121

5、8Luc、pll40Luc、p838Luc、p687Luc、p360Luc等系列缺失体质粒。进一步构建了含．809～一800位点的NF．1cB结合元件的突变体质粒p838mLuc和含有．1277—127l位点的cjun／AP-l结合元件的突变体质粒p1289mLuc和以及c-j啪的真核表达质粒pcDNA3．1-c．j腑。3．发现p216lLuc、p1289Luc、p838Luc在AtT20细胞中的活性随低氧时间延长而呈现增强的趋势，在24小时达到最大值。p216lLuc和p1289Luc的活性在低氧暴露8．12小时期间曲线平缓。4

6、．发现低氧暴露24小时，p838LuC在AtT20细胞中的活性与常氧对照组相比显著增强，这一现象可以被NF．1①抑制剂(PDTc)抑制；而突变体p838mLuc活性无明显增强。大鼠垂体CRHRl基因5’调控区．809一．800区域的结合元件在体外能与AtT20细胞以及大鼠垂体的核蛋白中的NF．1①结合，且低氧进一步增强二者结合活性，此结合可以被PDTC、p65抗体、100倍浓度的冷探针消除；突变探针(．809～．800)不再与NF．心结合。在整体低压舱模拟5km间歇低氧(10．8％02，4l们)条件下，CRHRlmRNA表达表现为

7、一个先下降后增强的过程，在第2天表达显著下降，第5天表达上升，二者均可被PDTC反转；7l

8、∞(7．8％02)连续低氧8h，C砌{R1n州A表达下降幅度更大，此结果同样可被PDTC反转。5．发现大鼠垂体CRHRl基因5’调控区．1277～1271区域的结合元件在体外能与AtT20细胞核蛋白中的c-juIl／AP．1结合，低氧暴露进一步增强二者结合活性，此结合可以被c-juIl磷酸化抗体、100倍浓度的冷探针消除。突变探针(．1277一1271)V¨I浙江大学博~上学位论文摘要不再与c-jull／AP．1结合。p1289Luc转染A

9、tT20细胞，低氧暴露24h后，C对{Rl基因5’调控区．1289～+347段的转录活性较常氧对照组增幅达到最大，此增幅可以被2甥pcDNA3．1-Cj珊的共表达完全抑制。结论1．CRFRl基因5’调控区．216l～+347参与低氧上调CIuRl基