AP-1和NF-κB荧光酶双报道系统的建立.pdf

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1、《癌症》C1ineseJournaIofCancer,2002,21(6)：701-703701·技术与方法·CACTCAGCATAAT3T，由医学遗传学国家重点实验室合成。1.4主要试剂及试剂盒AP-1和NF-!B荧光酶LipofecTAMINE，限制性内切酶双报道系统的建立Bgl、Hinc、EcoR、BamH购自美国生命技术公司。RPMI-1640培养基、佛波酯（TPA）购自Sigma公司。小牛血清罗非君，胡智，曾亮，赵晓荣，为华美生物工程公司产品。OIAGEN邓锡云，唐敏，易薇，曹亚＊pIasmicpu

2、rificationkit购自美国OIAGEN公司。DuaI-reporterAssaySystem购自(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所分子生物研究室，湖南长沙410078)Promega公司。1.5退火与连接方法关键词：激活蛋白1；核转录因子B；荧光酶双报道系统将人工合成的两条寡核苷酸单链按1f1的比例混合，95oC完全变性5min，中图分类号：R730.2文献标识码：B文章编号：1000-467X(2002)06-0701-03以每分钟1度降温至55C。在20%的非变性聚丙烯酰胺中分离纯化，测定DNA报道基

3、因广泛应用于基因表达和(nucIearfactor-B,NF-B)，建立了AP-1浓度后，于-20C冰箱保存备用。取100调节的研究，它对细胞信号转导研究具和NF-B荧光酶双报道系统；并将之应ngDNA与EcoR和Hinc酶切的质粒有重要意义。细胞信号转导通路具有网用于EB病毒潜伏膜蛋白介导的不同信DNA按1f1的比例混合，加1单位连接络化的特点，这要求在同一反应体系中号转导通路相互关系的研究。现将有关酶后在4C水浴中连接161，取全部连能同时确定一个以上基因或转录因子结果报道如下。接产物转化DH5感受态细菌

4、，在含氨的反式激活活性。常用的报道基因，如苄青霉素的LB培养基中筛选重组克1材料与方法对氯霉素乙酰转移酶基因的测定方法隆。存在操作繁琐等不足。萤火虫荧光酶1.1细胞系1.6大规模提取质粒的方法（firefIyIuciferase）和水母荧光酶（reniIIa鼻咽癌细胞系HNE2由中南大学湘用OIAGENPIasmicPurificationKitIuciferase）分别为61kDa和36kDa的单雅医学院肿瘤研究所建立，该细胞株为提取质粒。实验步骤按试剂盒提供的程体蛋白，其活化均不需翻译后修饰。萤低分化鳞癌

5、细胞株，EB病毒为阴性[1]。序进行。火虫荧光酶在ATP、Mg2+及氧存在下，1.2质粒1.7LipofecTAmlNE介导的瞬间细胞使甲虫荧光素（beetIeIuciferin）发生氧化NF-B水母荧光酶质粒带有与转染而发出光子；该系统可检测1020个荧光NF-B结合的顺式调控元件。p53报道按LipofecTAMINETM转染说明书，分子的荧光素酶，能用于一些低表达、质粒带有与p53蛋白结合的顺式调控元将细胞于24孔板培养241，待细胞生长启动子活性较弱基因的检测，且在107件，启动子下游均接有萤火虫荧光

6、素酶至约80%融合时弃培养基，Eppencorf管分子数以内呈线性关系。而水母荧光酶基因；pRLnuII质粒购自Promega公司，中无血清培养基、0.8I报道基因质粒利用氧而催化肠腔素（coeIenteraxine）生含有T7启动元件，其下游连接有水母和2.5ILipofectamine后混合，置室温成水母发光蛋白发出蓝色荧光。这两种荧光酶基因。下45min，加入培养孔后，再补加200I荧光酶在进化上起源不同，其结构和所1.3寡脱氧核苷酸无血清培养基，在37oC、5%CO2培养条需底物也各异；利用这种差异可

7、以建立设计含有三个AP-1结合位点的两件下，转染51后，换含10%血清的培养荧光酶双报道系统。本研究通过合成条寡脱氧核苷酸单链，由中科院上海细基，继续培养[2]。带有水母荧光酶基因的激活蛋白1胞所合成，正链为：5TAGCTTGATGAGTC1.8荧光素酶活性分析(activatorprotein,AP-1)报道质粒，插入AGGATCCATGAGTCAGGATGAGTCAGC按DuaI-ReporterAssaySystem测定带有荧火虫荧光酶的核转录因子BG3T，负链为：5TAATTCGCTGACTCATCC

8、T说明书略做修改。将细胞用PBS洗两GACTCATGGATCC遍，加100IPBL（PassiveLysisBuffer），收稿日期：2001-11-05;修回日期：2001-12-21TGACTCATCA3T，裂解30min，将细胞刮下，收集蛋白裂解基金项目：国家重点基础研究发展规划(973“)恶性肿瘤发退火后两端能形液，21000r/min离心15s，取10I样生发展的基础研究项目(G19980