《细胞培养流程》doc版

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3、夜（>16-18h）7.涮单蒸水三次8.50-60℃24h烤干后，铝薄纸、牛皮纸封闭瓶口，铺巾包裹9.120℃，100kPa高压20min，50-60℃24h烤干备用（2周内）常用溶液配制DMEM溶液的配制1制备新鲜三蒸水。过滤器装好0.22μm滤膜，用三蒸水湿润，120℃，100kPa高压20分钟。2将一包DMEM培养基干粉倒入烧杯，用三蒸水洗包装袋内面2-3次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌（1-2h）使之完全溶解。3根据包装袋上的要求补加所需量的碳酸氢钠（0.02g）；根据实验需要，添HEPES

4、（5-20mmol/L）、谷氨酰胺和其他特殊物质。4加入100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。5必要时用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH。加水定容至1L。pH7.2-7.4。6负压泵连接过滤器过滤除菌，分装于无菌100ml生理盐水瓶中（90ml/瓶），20℃冻存。配制好的培养液使用时，37℃复温，根据需要加入血清（5%-20%）培养细胞。4HEPES(260.3)15mMHEPES3.905gDistilledwater1000ml(或直接加入1L培养基中)常用平衡盐溶液（balancedsaltsol

5、ution,BSS）配制方法(g/L)RingerPBSHanksD-HanksDulbeccoCaCl20.25--0.14----KCl0.420.20.40.20.2KH2PO4--0.20.060.20.2MgCl·6H2O----0.10----MgSO4·7H2O----0.10----NaCl9.08.08.08.08.0NaHCO3----0.35--Na2HPO4·2H2O(269)--1.560.092.162.16NaH2PO4·2H2O----------D-glucose----1.0----酚红

6、----0.010.02--消化液配制0.25%Trypsin+0.02%EDTA(pH8.0,37℃)Trypsin(1:250)0.25gEDTA0.02gD-hanks(Ca2+/Mg2+free)100ml0.22μm滤膜过滤除菌后分装于高压灭菌过的小青瓶中。-20℃冻存。4Cryopreservationsolution(冻存液)DMSO（二甲基亚砜）/甘油（高压灭菌）1ml（10％）胎牛血清2ml（20％）培养液7ml（70％）原代细胞培养骨髓细胞培养1、高压手术器械及玻璃器皿：小弯剪（2）、小弯镊（2）、皮镊

7、（1）、过滤网、离心管（4）、吸管（4）、小圆试管（4）、平皿（2）2、方法①器械盒等放入超净台，紫外灯消毒30分钟②酒精灯烧试管、离心管等备用，平皿中加入L-DMEM—10％FCS③处死或过量麻醉实验动物，浸泡于75％酒精5分钟④小心分离取双侧股骨，勿破坏骨髓腔，放入平皿中，剥离其他组织⑤移入另一平皿，放入超净台，从中间剪断股骨，5ml注射器反复抽吸、吹洗⑥经滤网过滤去除组织块，移入离心管⑦800-1000转/分离心，3-5分钟，2次⑧加培养基缓力吹打混匀细胞后，移至50ml培养瓶，37℃，5％CO2培养⑨MSC一般2天

8、后换液，肿瘤细胞24h后换液细胞传代细胞长满80％瓶壁后，消化传代1、吸除原培养瓶中的培养液，用无血清培养基洗一次。2、瓶内加入0.25％trypsin＋0.02％EDTA消化液（原代因细胞成分较杂，加EDTA较容易消化下来，传代后的细胞一般只用trypsin消化即可），平摇培养瓶，使消化液流过细胞表面