p115rhogefrhoa信号通路参与调控lps及tnf-α致脑微血管内皮细胞通透性增高的机制研究

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1、博士学位论文p115RhoGEF／RhoA信号通路参与调控LPS及TNF-a致脑微血管内皮细胞通透性增高的机制研究Theroleofpll5RhoGEF／RhoApathwayinLPSandTNF．a-Inducedbrainmicrovascularendothelial_■l^·■barrierdysluncUon作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导老师：邓小鹿儿科学湘雅医院尹飞教授论文答辩日期土隆兰：鉴答辩委员会主席鼓中南大学二O一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所

2、知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：里壬逸曰期：递!：．年』月笪日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国

3、学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：二)王!垒导师签名日期她年生月堑日本课题受以下基金资助国家自然科学基金：内毒素脂多糖致血脑屏障紧密连接改变的分子机制研究项目批准号：30872790博士学位论文中文摘要摘要感染性脑损伤是儿科常见的危急重症，虽然随着高效抗生素的广泛应用，近年死亡率有所下降，但其致残率仍然很高，存活的患儿中约有30％．50％留有严重的神经系统后遗症。感染性脑损伤时血脑屏障(blood．brainbarrier，BBB)通透性增高所致的颅高压是其患者致死或致残的主要原因之一。脑微血管内皮细胞(bra

4、inmicrovascularendothelialcells，BMECs)及BMECs间的紧密连接(tightjunction，TJ)是维持BBB结构和功能完整的主要成分及结构基础。已有的研究发现多种因素参与了感染性脑损伤时BBB通透性增高的发生发展，涉及细菌毒素如脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)、细胞因子如肿瘤坏死因子一0【(tumornecrosisfactor-a，TNF．0【)与BMECs的相互作用。目前对TJ的研究主要以肺微血管内皮细胞或上皮细胞为对象，感染性脑损伤时LPS致BMECs通透性增高、BMECs．

5、TJ改变及其调控机制的研究较少。小分子G蛋白Rho(Rashomologous，Rho)属于Ras超家族，包括Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac和Cdc42三个亚家族，在细胞骨架的相关活动如细胞迁移、轴突导向、细胞变形、收缩粘附等过程中发挥重要的作用。其中，RhoA、Racl和Cdc42是研究最为深入的成员。RhoA通过其上游的鸟苷酸交换因子(guaninenucleotideexchangefactors，GEFs)与G蛋白耦联受体(GPC心)密切联系；RhoA下游的Rho激酶激活后可取代肌球蛋白轻链激酶(myosinlight

6、chainkinase，MLCK)直接磷酸化肌球蛋白轻链(myosinlightchain，MLC)，提高肌球蛋白活性，使肌动．肌球蛋白交联增加，导致细胞收缩，细胞间隙博士学位论文中文摘要扩大。本课题组的前期研究发现，应用Rho激酶特异性抑制剂Y一27632可以部分抑制LPS诱导的体外BBB通透性增高，提示LPS可能通过RhoA信号途径影响BBB通透性。因此，研究LPS及TNF．仅对BMECs的影响并探讨其具体的调控机制，有助于了解感染性脑损伤时BBB通透性增高的病理过程，为其临床防治提供新的思路。本研究分为三部分：第一部分LPS对原代大鼠B

7、MECs通透性的影响及机制目的：探讨LPS对大鼠BMECs通透性的影响及其可能的机制。方法：分离和培养原代大鼠BMECs，随机分为对照组禾I]LPS干预组。利用跨内皮细胞电阻抗(transendothelialelectricalresistance，TEER)检测BⅧCs通透性，pull．down法测定RhoA活性，Westernblot检测pl15I也oGEF和TJ蛋白ZO．1、occludin、claudin．5蛋白表达变化。结果：与对照组(159．o土8．6Q·cm2、)比较，LPS作用3h时大鼠BMECs的TEER值明显下降(108

8、．3土4．21Q·cm2)，作用12h时LPS干预组TEER达最低水平(85．4士2．52Q·cm2)。Pull—down法证实LPS作用5min后RhoA活性增高