脂多糖刺激心脏微血管通透性增高的机制研究

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文答辩委员会主席：郑良荣答辩委员会成员：郑良荣张怀勤唐礼江论文答辩日期：2014年5月19日万方数据温州医科大学硕士学位论文中文摘要英文摘要目录

2、JIIIIIIIIIIIIIIIIY2691557材料和方法结果分槭与试论结论参考文献附录致谢3一⋯一⋯⋯⋯一一．6一一一一一⋯一20综述及参考文献独创性声明⋯⋯24⋯⋯⋯．25⋯⋯28．．．．．．．．．．．．．．293035万方数据温州医科大学硕士学位论文脂多糖刺激心脏微血管通透性增高的机制研究中文摘要目的探讨脂多糖刺激心脏

3、微血管通透性增高的可能机制。方法取1月龄SD大鼠心脏，机械分离出左心室中内3／4，充分剪碎组织，采用蛋白酶消化法原代培养及纯化大鼠心脏微血管内皮细胞，采用倒置显微镜形态学观察，采用Ⅷ因子和CD31免疫细胞化学染色和体外小管形成实验鉴定，传代并采用P2~4代。体外单层内皮细胞通透性实验检测不同浓度不同作用时间脂多糖(LPS)束0激大鼠心脏微血管内皮细胞通透性的变化，蛋白免疫印迹法和免疫荧光细胞化学技术检测不同浓度不同作用时间LPS刺激大鼠心脏微血管内皮细胞中整合素p3表达的部位和变化，选取最佳LPS作

4、用浓度和作用时间。采用整合素p3过表达腺病毒转染和特异性封闭抗体抑制整合素p3活性，体外单层内皮细胞通透性实验检测整合素B3过表达和封闭后大鼠心脏微血管内皮细胞通透性的变化。罗丹明鬼笔环肽染色检测LPS刺激和整合素B3过表达腺病毒转染后细胞骨架F．actin的变化。采用特异性抑制剂抑制Src／Racl活化，体外单层内皮细胞通透性实验检测各处理组通透性的变化。采用蛋白免疫印迹法检测LPS刺激和整合素p3过表达腺病毒转染后Src及Racl活性的变化。结果(1)大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养及鉴定。原代培

5、养时接种2h大部分已贴壁完成，24h细胞充分伸展，呈短梭型、三角形或多角形，细胞散在分布或呈集落状生长。细胞长至融合后呈典型的“铺路石”或“鹅卵石”征。原代周期3~4d，传代周期2～3d。Ⅷ因子和CD31免疫细胞化学染色阳性率95％以上，1％FBS条件下培养16h可见体外小管形成。(2)LPS刺激后，心脏微血管的通透性增高。LPS刺激6h单层大鼠心脏微血管内皮细胞通透性变化呈浓度依赖性，在20ng／mL时开始升高，50ng／mL达高峰，100ng／mL起下降至平台期。LPS(50ng／mL)束U激单

6、层大鼠心脏微血管内皮细胞通透性变化呈时间依赖性，表现为逐渐增高，6h起有统计学意义。(3)整合素p3表达于大鼠心脏微血管内皮细胞表面，不同浓度LPS刺激6h后，整合素口3表达先增高后降低，10ng／mL组和20ng／mL组表达显著增加，50rig／mE组开始表达显著下调，但100ng／mL组、lpg／mL组与50ng／mL组表达量相仿，并无统计学差异。LPS(50ng／mL)N激不同时间后，6h起整合素p3表达逐渐降低。整合素p3过表达腺病毒转染24h后，整万方数据温州医科大学硕士学位论文合素B3表

7、达较正常对照组和LPS组显著增加。(4)整合素p3改善LPS刺激后心脏微血管的高通透性。整合素p3封闭组LPS刺激后通透性较LPS组显著升高，整合素B3过表达组LPS刺激后通透性较LPS组通透性显著降低。(5)整合素p3可能通过减少细胞骨架蛋白重构增强血管屏障功能。正常情况下细胞骨架蛋白(F．actin)主要分布于细胞周边，LPS刺激后F．actin重构，杂乱无序，形成应力纤维(StressFibers)。整合素B3过表达后可有效抑制F—actin重构，减少StressFibers形成。(6)抑制S

8、rc／Racl信号途径可显著改善LPS刺激后心脏微血管的高通透性。抑制Src活性后予LPS刺激，其通透性较LPS组显著下降。同样，抑制Racl活性后予LPS刺激，其通透性较LPS组也显著下降。(7)整合素B3不影响Src／Racl信号途径活化。与正常对照组相比，LPS刺激后，Src和Racl活化显著增加，整合素B3过表达组LPS刺激后Src与Racl活化与LPS组相比较均无显著变化。结论本研究探讨了LPS刺激心脏微血管通透性增高的可能机制。发现LPS刺激后整合素p3的表达有显著变化，而且整合素D3对

9、LPS刺激心脏微血管引起的高通透性有保护作用，整合素B3过表达后能显著降低LPS诱导的心脏微血管高通透性，而整合素B3特异性封闭抑制活性后LPS诱导的心脏微血管的通透性显著增高。整合素B3可能通过抑制细胞骨架重构增强LPS刺激后心脏微血管屏障功能，但作用机制并不通过影响Src／Racl信号途径活化。整合素p3及其潜在的作用机制可能成为脓毒症心脏微血管高通透性治疗的一个新的靶点。关键词脂多糖；心脏微血管通透性；整合素133；细胞骨架万方数据温州医科大学硕士学位论文ABS