原发性高血压患者线粒体dna变异与单体型分析

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1、温州医学院硕士学位论文原发性高血压患者线粒体DNA变异与单体型分析姓名：宋亚曼申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：管敏鑫；吕建新；卢中秋2012-05-12温州医学院硕士学位论文原发性高血压患者线粒体DNA变异与单体型分析摘要目的1．采集温州地区原发性高血压患者和健康人群的血液标本，收集详尽的临床资料，建立原发性高血压患者临床资料和遗传学数据库；2．探索原发性高血压的危险因素和病因，尤其是线粒体基因背景对该病发生发展过程的影响；3．找出可能导致母系遗传原发性高血压的线粒体基因变异及单体型，为后续的功能实验

2、奠定基础。方法采用分析流行病学研究常用方法“病例对照研究”设计实验，选择一组患原发性高血压的病人作为病例组，再选择一组血压正常的受试者作为对照组，比较两组人群在线粒体基因组方面的差异。与温州医学院附属第一医院相关科室建立合作关系，收集符合条件且愿意接受调查研究的原发性高血压患者和健康受试者的血液样本、个人信息、体格检查和实验室评估资料；从血液样本中提取全基因组DNA，以此为模板扩增所有样本的线粒体基因全序列，纯化后送专业公司进行测序。用适合的生物软件分析测序结果，寻找并记录每个样本的线粒体DNA变异，与两个线粒体数据

3、库进行比较，找出未报道的变异位点。采用人工和软件相结合的方法，分析所有样本的线粒体单体型，绘制线粒体基因进化树。最后采用适当的统计学方法，对比原发性高血压患者组和对照组之问在线粒体基因变异及线粒体基因单体型之间的差异，找出可能有与原发性高血压有关的突变位点和线粒体基因单体型。结果1．本课题共采集到354例受试者的血液样本及其完整的临床资料，其中包括原发性高血压患者243例，正常对照样本111例；提取了所有受试对象的外周血全基因组DNA样本，建立了原发性高血压患者和健康人群DNA库；2．扩增了受试对象的线粒体基因组，测

4、序获得354例完整的线粒体基因测序峰图；分析了全线粒体基因序列，在实验组共发现1004处变异，累积变异次数为9278次；在正常对照组共发现696处变异，累积变异次数为4123次；3．原发性高血压患者组的mtDNA变异密度高于正常组，尤其是tRNA基因区域；两组的最高变异频率均出现在D．Loop区；4．在原发性高血压患者组发现8例样本携带已报道的与原发性高血压相关的线粒体DNA突变，包括携带12SrRNAA1555G突变和tRNA№‘A4435G突变的样本各3例，携带tRNA№‘T4454C突变的样本2例；温州医学院硕

5、士学位论文一——————————————————————————————————————————————————一5．发现两个线粒体数据库均未收录的新变异位点115个，包括D—Loop区3个，rRNA基因区5个，tRNA基因区9个，ATP合酶亚基编码区8个，NADP还原酶亚基编码区53个，细胞色素b亚基编码区27个，细胞色素c氧化还原酶亚基编码区10个，其中非同义突变共30个；6．对新发现的tRNA基因变异进行保守性分析，确定其中3个位点在16个灵长类动物间的保守性大于75％，分别为tRNAlmA5514G、tRNA

6、AspT7546C和tRNAG1YT10010C突变；7．确定了原发性高血压患者组和对照组样本的线粒体单体型，绘制了354例样本的线粒体基因进化树；8．统计分析发现原发性高血压患者组与对照组的线粒体基因单体型构成比差异明显，其中以B4、C7、D4和A4、B5、M7b这6个线粒体单体型亚型在两组问的差异尤为显著；C8414T和C14668T两个D4亚型的标签SNP和在原发性高血压患者组与对照组问的比例差异明显。结论1．由于原发性高血压患者组在线粒体基因各功能区的变异密度均高于正常对照组，说明线粒体DNA变异可能是原发性

7、高血压的分子基础之一；2．虽然D．100p区为非编码区，且多数变异都是多态性位点，但由于该区对mtDNA的复制、表达有重要的调节作用，同时大量多态性位点的累积损伤效应可能会导致氧化应激作用，所以D．Loop区变异可能参与了疾病过程；3．尽管新发现的3个保守性较高的tRNA基因变异是否有致病作用以及致病机理尚未阐明，但已有报道研究了其它tRNA基因上与之对应的突变位点，且己通过功能实验证实这些突变会导致线粒体功能障碍，因此，这三个新的tRNA基因变异可能也会引起线粒体机能紊乱；4．新发现的30个非同义突变中有25个在对

8、照组未检出，鉴于线粒体基因编码的多肽参与了包括氧化磷酸在内的多个生物学过程，这些非同义突变很可能导致了线粒体功能障碍，并参与了原发性高血压的疾病过程；5．由于实验组中单体型亚型B4、C7、D4的比例明显高于对照组，A4、B5、M7b的比例明显低于对照组，推测前一组单体型可能在原发性高血压的发生发展中起着协同作用，后一组则可能起到一定的保护作用；