桃流胶病原菌botryosphaeria spp.鉴定、分布、遗传多样性及pcr快速检测技术研究

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1、华中农业大学博士学位论文桃流胶病原菌BOTRYOSPHAERIASPP.鉴定、分布、遗传多样性及PCR快速检测技术研究姓名：王璠申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：李国怀201206桃流胶病菌Botryosphaeriaspp．鉴定、分布、遗传多样性及PCR快速检测技术研究摘要葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌是许多单子叶、双子叶和裸子植物上常见的病原菌、内生菌和腐生菌。能引起许多多年生木本植物产生溃疡、枯萎、坏死和流胶等症状。桃(PrunuspersicaL．)流胶病过去多认为是逆境和管理粗放等引起的生理性病害，而葡萄座腔菌属真菌在我国作为桃流胶病病原菌并没有进

2、行系统的研究。桃流胶病主要为害枝干，造成主干、主枝等部位树皮产生胶状溢出物，树胶初期无色透明，随时间推移逐渐变成红褐色至深褐色。湖北省是我国重要的桃产区，流胶病发生严重，本研究从湖北省桃流胶病病原学入手，在分生孢子形态学、培养特性、分子系统学和致病性研究的基础上，对桃流胶病菌进行鉴定。同时，设计PCR特异性引物用于病原菌快速检测；对不同桃品种的抗病性进行评价等。主要结果如下：1．我国湖北省桃流胶病菌为FusicoccumaesculiCorda，DiplodiaseriataDeNot．和Lasiodiplodiatheobromae(Pat．)Griff&Maubl．。Botry

3、osphaeriaspp．作为桃流胶病菌最早是20世纪70年代在美国Georgia州报道的。到目前为止，我国报道的引起桃流胶病的该属真菌只有Botryosphaeriadothidea(Moug．)Ces．&DeNot．。湖北省是我国桃生产的重要产区，流胶病发生普遍。为了解该省桃流胶病的发生情况，在咸宁市、武汉市、孝感市、随州市、远安县(宜昌市)等地调查了14个果园的1914棵桃树，总发病株率99．2％。从武汉市、咸宁市、孝感市、远安县(宜昌市)、随州市、老河口市(襄阳市)、沙洋县(荆门市)、公安县(荆州市)、枣阳市共采集桃流胶病枝条170份，获得116个Botryosphaeri

4、aspp．分离株。结合菌落培养特性、分生孢子形态学、致病性测定和rDNA内转录间隔区(rDNAITS，ITSl．5．8S．ITS2)、D微管蛋白(B．mbulin)和o【延伸因子(EFl．0【)的分子系统学将湖北省桃流胶病菌鉴定为：Eaesculi(有性阶段最dothidea)、D．seriata(有性阶段丑obtusa(Schwein．)Shoemaker)和Ltheobromae(有性阶段B．rhodina(Cooke)Arx)，其中Eaesculi分离频率最高，分布最广泛：L．theobromae仅在沙洋县发现；D．seriata在公安县有分布。人工菌丝块接种当年生新梢和多年

5、生枝条结果表明，这三种真菌对桃树都有致病力，能产生褐色病斑；L．theobromae致病力最强，且能引起多年生枝条产生大量胶液；D．seriata致病力最弱。华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．通过分生孢子形态学、致病力测定、分子系统学和微卫星分析证明了我国桃流胶病菌Eaesculi的遗传多样性。形态学研究表明，我国桃流胶病菌Eaesculi主要有两种类型的分生孢子，一种是典型的纺锤形至椭圆形、无色透明的无隔Fusicoccum属分生孢子；另一种是纺锤形的一分隔分生孢子，并不是很常见。致病力试验中，18个Eaesculi分离株接种曙光油桃新梢5d时，病斑长度差异显著，最长达

6、40．1turn(菌株XNHG-241)，最短仅5．8nHn(XNHG．62)。ITS、p-tubulin和EFl·Q3个基因的分子系统学分析进一步证明了Eaesculi是我国最常见的桃流胶病菌，分布范围最广，存在种内分化现象。利用微卫星引物M13，T3B和(CTC)4RC获得了DNA指纹图谱，0．1矩阵在SAS8．1软件中Cluster(聚类)和建树(Tree)分析表明我国桃流胶病菌Eaesculi可以分为7类。第一类包括FH．11，MYA．6，HB．14，XG-52，WX．12，XX．25，SHYJ．1，CDA．20，CD．13，HB．11，YLA．6，WX．10，XX-1，W

7、Xll-12，SH．15，XX．23，Fy-24，FYl7，XX．44，JZ．7，GA．323，TA．44，JM．5，WH一1252等24个菌株；第二类包括CH．11，FYY．1，ZJG-42，FH．10，WX．3，JMA．1112等6个菌株：第三类包括菌株WH．1822；第四类包括菌株TA．1；第五类包括菌株JM．20；第六类包括菌株CSJ．10；第七类包括菌株SH．5。3．设计了桃流胶病EaescuH的特异性引物。在fl-tubulin基因序列区域设计了一个正向引