几种桉树焦枯病原菌的快速分子检测技术研究

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1、分巧号Ｓ７６３．１３单号：Ｓ２０＂３９０２四Ｗ巧化大学硕女学位论文几种按树焦钻病原菌的快速分子檢測技术硏究张静指导老师：朱天括巧巧专业名巧巧採保妒学研巧义向分子生衡学巧棘乂病理中的应用２０１５年５月ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＮｕｍｂｅｒ：Ｓ７６３」３ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙ’ＭａｓｔｅｒｓＤｅｒｅｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｙＦｏｕｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔＫｉｎｄｓｏｆＭ

2、ｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｈｅｎｄｕ６１１１００ｇ，ｇ，，Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＪｕｎｅ２０１５，论文独削性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或。尽我所知集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学一位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示

3、了谢意。《，研究生签名：０ｊｒ年月日＞ｆ＾Ｊ关于论文巧用授巧的芦明本人完全了解四川农业乂学有关保留，；学校有权保留并向国家巧关、使曲学位论文的规定即＾部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被巧阅和借阅，可以采用影印、缩印或妇描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业火学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。论文不保密。□本论文保密，在年解密巧适用本授权。＿＿＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）－研究生签名：＞？ＬＴ年＾月／日导师签名■年《月日ｙｗｒ）摘要

4、是桃金娘科Ｍａｃｅａｅ按脚属炸如化■按树祀Ｍｃａ如化ｓｐｐ．）（ｙｒｔ）５胆物的总称，同时是世界著名的用材林树种和速生树种，与杨树、松树并称为林业上的Ｈ大速生造林树种。按树在我国西南、东南、长江中下游等地区的化态环境建设凶及解决生物能源问题中发挥着不可替代的作用，具有重要的经济、社会、生态效益。目前在我国西南地区由半知菌亚口的帝梗柱抱属真菌（砂／細ｉｒａｃ／ｏ況ＷＷｓｃｏｐａ州Ｗ２）引起的按树焦枯病严重危害着按树的林业生产建设。由于该病害发病症状极易与其他按树叶部病害混淆，传统形态学鉴定存在困难，因此建立能

5、够在病害发生早期快速诊断病害的分子生物学诊断方法迫在眉－睫，分别建立了基于ＩＴＳ与ｆａｃｔｏｒ１ａｌｈａ序列枝树焦枯。本研究选定不同的禪基因序列ｐ病菌的双重ＰＣＲ检测体系、巢式ＰＣ民体系、环介导等温扩增反应体系（ＬＡＭＰ）Ｈ种分子生物学诊断技术，Ｗ期为按树焦枯病的林业生产建设提供有力的技术保障。本研究联得如下结果：１ＩＴ－１ａａ．成功构建了基于Ｓ与ｆａｃｔｏｒｌｐｈ序列按树焦枯病菌的双重ＰＣ民检测体系。该体系Ｗ按树焦枯病原菌況Ｍｍ为模版，分别打Ｓ和ｆａｃｔｏｒ＊＊－１ａｌｈａ序歹ｉｊ为鞋１区域ｏｃ

6、／幻況ＭＷ属和Ｃｙ＂内油ｏｃ／幻成ＷＷｓｃｏｐ口Ｗｗｎ设计了ｐ，针对Ｃｙ／ｍ办／－Ｓ－－Ａ－ＣＹＳ１ＣＹ沿和邸１／ＥＦ１两对特异性引物，建立了基于属和种的双重ＰＣＲ快速检一测技术。利用引物ＢＣＹＳ１／ＣＹＳ２可１＾将全部属的供试菌株扩增出条３５１ｂｐ一－－－Ａ－１Ｒ大小的条带，单独用特异性引物ＥＦＳ１／ＥＦ进行ＰＣ扩增仅病原菌扩増出条１９７ｂｐ大小的条带，同时使用２对引物时，病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度°为５３Ｃ时，ＤＮＡ灵敏度检测限度达到４５０ｆｇ／叫野外田间时效检测结果显示，该体系能准

7、确检测出不同发病程度枝树组织上的病原菌，完全符合田间检测的要求。＇－，２加（加ｅａｔｅｎｅ．针对写）ｃ／ｆｌ成ｗｍｓｃｏａｎｉｗｚ茜株的ｂｔｕｂｕｌｉｎ上保守序列极强的祀基＾ｐｇ－－－－－－－Ｓ－Ａ的设因区域序列进行特异性引物ＢＴ１／ＢＴＡ１和通用引物ＢＴＴ１Ｓ／ＢＴＣＹＬＴＵＢＩＲ计和合成，分别利用常规ＰＣ民和巢式ＰＣ民技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较，同时对所建立的巢式ＰＣＲ用于按树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。结果ｅｔａ－ｔｅｎｅ序－Ｔ－－表明，利用ｂｕｂｕｌｉｎｇ列通用引物ＢＴ１Ｓ

8、／ＢＴＣＹＬＴＵＢＨＩ对全部供试菌株进行扩增一而单独使用特异性引物，所有参试菌株均可扩增出条５００ｂｐ左右大小的条带；一－－－－ＳＴＳ１／ＢＴＡ１进行常规ＰＣ民扩增时仅病原菌能够扩增出条大小为１４８ｂｐ的明亮条１一