万州猕猴桃溃疡病病原菌的分离鉴定及环介导等温扩增快速检测

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1、万州猕猴桃溃疡病病原菌的分离鉴定及环介导等温扩增快速检测重庆大学硕士学位论文(学术学位)学生姓名：吴晓芳指导教师：王中康教授专业：生物学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一五年四月IsolationandidentificationofthecausalagentforkiwifruitbacterialcankerinWanzhoudistrictofChongqingandthedetectionmethodconstructionofloop-mediatedisothermalamplificationAThesis

2、SubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’sDegreeofScienceByWuXiaofangSupervisedbyProf.WangZhongkangSpecialty:BiologySchoolofLifeSciencesChongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2015重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要猕猴桃溃疡病是一种对猕猴桃产业威胁重大的毁灭性病害。目前，该病害

3、在国内外均有发生。重庆作为种植猕猴桃的主产区，近年来也饱受溃疡病的为害。为了使重庆的猕猴桃溃疡病病原菌种类与特征得以明确，更好地为检疫和防治当地病害提供理论依据，本研究从重庆万州孙家镇、响水镇和铁峰乡的不同果园采集感染溃疡病的红阳猕猴桃枝条、叶片等，分离其病原菌，运用传统的表型测定、生理生化测定和致病性测定等，结合分子生物学方法对病原菌进行详细鉴定。基于猕猴桃溃疡病菌的avrD1基因设计引物，优化各种参数，建立了猕猴桃溃疡病菌的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检

4、测方法，为病害在田间的快速诊断奠定了基础。主要研究成果如下：传统方法对猕猴桃溃疡病病原菌的鉴定：本研究从采集的病组织上共分离纯化得到10株病原物，分别将其命名为CQPsa-01至CQPsa-10。这些菌株的形态特征基本上相同，在KBA培养基上均表现为圆形、奶白色、全缘、微凸、表面光滑，半透明等。革兰氏染色结果表明分离细菌为革兰氏阴性菌。以陕西菌株M7作为标准菌株，对分离的10个菌株进行培养性状和生理生化测定，结果表明，在所有测试指标中，这些分离菌株与M7结果完全一致。对10个菌株进行致病性测定，所有菌株均可使烟草叶片产生过敏反应

5、，接种供试菌株的猕猴桃枝条和叶片，在一定条件下培养后均发病，发病症状与田间自然发病的典型症状一致，再次分离后获得一致的病原，完成了柯赫氏法则证病。分子方法对猕猴桃溃疡病病原菌的鉴定：利用细菌16SrDNA片段的通用引物27F/1492R，对标准菌株M7和分离的10株病原物进行PCR扩增并以扩增片段序列构建系统发育树进行系统发育分析，结果显示菌株M7和10株病原物与丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)JN378726.1菌株的亲缘关系最近，但是不能与丁香假单胞菌茶致

6、病变种(P.syringaepv.theae)区分。利用特异性引物PsaF1/R2、KNF/KNR和AvrDdpx-F/R分别对M7菌株和10株病原物进行RG-PCR和双重PCR扩增，电泳检测结果表明所有菌株都扩增出大小分别约为280bp、492bp和226bp的目的条带，由于在所有Psa的近缘种中，双重PCR仅能对Psa同时扩增出两条目的条带，所以可以确定本实验分离的10个菌株均为Psa。利用根据陕西Psa菌株设计的引物ChinaF/R和根据四川Psa菌株设计的引物F7’/R7’分别对M7菌株和10株病原物进行PCR扩增，电泳

7、结果表明ChinaF/R仅对3个菌株M7、CQPsa-08和CQPsa-10扩增出一条609bp左右的目的条带，而对其它CQPsa菌株不扩增或扩增出2-5条非特异性条带；F7’/R7’对M7菌株和10株I重庆大学硕士学位论文中文摘要病原物均扩增出很多条基本一致的非特异性条带。以上结果说明陕西Psa、四川Psa和重庆Psa的某些基因存在差异，且重庆万州的Psa菌株之间也存在差异。猕猴桃溃疡病病原菌LAMP快速检测方法的建立：根据Psa的avrD1基因用PrimerExplorerV4软件设计引物，初步建立LAMP反应体系，并对其进

8、行优化，最终建立了Psa的LAMP快速检测方法。产物通过观察白色沉淀和SYBRGreenI染色后的颜色变化，可以直接判定样品的检测结果。以分离自猕猴桃的23种内生细菌和其他几种植物病原菌为阴性对照菌株，对LAMP引物进行特异性验证，结果显示只有Psa菌株能扩增出