杨梅素抗肝肿瘤细胞hepg2作用及其机制探究

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1、杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制探［摘要］目的探讨杨梅素对肝癌细胞HepG2的生长抑制和诱导凋亡作用及其作用机制。方法应用甲基喙哇蓝(MTT)比色法，测定杨梅素对HepG2细胞株活性的影响，检测其抑制HepG2细胞株的时间效应和剂量效应；应用形态学观察、HE染色和AnnexinV-PI流式检测，测定杨梅素对HepG2细胞的凋亡作用，并进行细胞周期的分析，最后对杨梅素对细胞凋亡相关的蛋白p34cdc-2、CyclinBl.Bcl-2和PARP的影响进行了研究。结果杨梅素对HepG2细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用，且呈时间依赖和剂量依赖性，表现为：细胞G2/M期阻滞，出现明显

2、的凋亡峰；Bliss法测定杨梅素对HepG2细胞的IC50值为(32.18±2.31)umol/L,30、50umol/L杨梅素对G2/M期细胞比率分别为(41.32±0,90)%和(80.07±0.90)%,差异有统计学意义(P<0.05)；p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而CyclinBl蛋白的表达量明显上升,Bcl-2蛋白的表达量锐减,并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白(113kD)水解为89kD的特异性水解产物。结论杨梅素通过激活Caspase家族蛋白实现对肝癌细胞HepG2细胞株的增殖抑制及诱导凋亡作用。［关键词］杨梅素；肝肿瘤细胞；HepG

3、2；凋亡［中图分类号］R735.7［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2012)12(c)-0007-03［Keywords］Myricetin；Livercancercell；CelllineHepG2；Apoptosis杨梅素(myricetin,MYR)是从天然植物藤茶(葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物)、杨梅等树皮中提取得到的多释基黄酮类单体化合物，主要存在于杨梅的树皮中，其中嫩叶茎叶中含量较高，具有显著的生物活性，如抗肿瘤、降低神经毒性、影响淋巴细胞活化和增殖、拮抗血小板活化因子(RAF)、抗氧化抗衰老、保肝退黄以及降血糖等作用［1］。其中，杨梅素在抗肝肿

4、瘤方面的作用日渐备受关注［2-6］o近年来，国内不少学者对其抗肝癌作用机制方面做了大量的总结和研究［5-6］,主要是介绍杨梅素能有效诱导肿瘤细胞的凋亡，然而，由于研究并不深入，未能从分子生物水平上阐释杨梅素的抗肿瘤机制。本文通过甲基嗟哇蓝(MTT)法对细胞增殖活力进行检测、倒置相差光学显微镜下观察荧光染色细胞生长形态、AnnexinV-PI流式检测HepG2的细胞生长周期以及进一步的DNA片段电泳等实验，表明杨梅素通过影响肿瘤细胞HepG2的生长周期诱导细胞凋亡从而发挥其抗肝癌作用，并深入揭示起作用机制与激活Caspase家族蛋白直接相关。1材料与方法1.1材料1.1.1仪器Ol

5、impusCKX41临床型倒置显微镜，德国MACSQuantTM流式细胞仪，上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-III型CO2细胞培养箱。1.1.2试剂及耗材人类肝癌细胞HepG2（购于广州市中山医科大学病理科），小牛血清（购于广州蕊特生物科技有限公司），杨梅素（由广州市中山大学药学院制备并提供,HPLC纯度高于95%）,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（包括Caspase-3和Caspase-9）以及DNA引物试剂（均购于美国CST生物工程有限公司），RPMI1640和DMEM培养基（购于上海阳光生物技术有限公司），96孔培养板（购于广州市华粤行有限公司）。澳化乙锭、磷酸盐缓冲液（PBS,

6、pH7.2）、二甲亚矶（DMSO）、琼脂糖、MTT等其他试剂，均为分析纯，购于广州化学试剂厂。1.2方法1.2.1杨梅素溶液的制备取杨梅素纯品适量，精密称定，用0.1%DMS0溶液溶解并稀释至杨梅素浓度为100umol/L；临用时DMEM培养液稀释。1.2.2MTT法检测细胞死亡率和细胞增殖活力以7000/孔的密度接种于96孔板，每孔180PL,培养过夜，静置，分别加入10uL由0〜60umol/L不同浓度的杨梅素单体化合物溶液，并设置阴性对照组。药物作用48h后培养结束前4h加入MTT,继续培养4h后倾去培养液,加入DMSO100nL使溶解、显色，用酶联仪以570/630双波长

7、测定，以杨梅素浓度（umol/L）为横坐标，细胞死亡率（%）为纵坐标，绘制杨梅素对HepG2细胞增殖影响的曲线图，并利用Bliss法算出细胞抑制生长率达50%时的杨梅素的药物浓度，以IC50值表示。1.2.3荧光染色细胞形态观察从MTT法检测细胞死亡率的结果中，选定一定浓度的杨梅素单体化合物溶液。以100000个/孔的细胞密度接种于6孔板（具有玻片）中，培养24h后，加入选定浓度的杨梅素溶液，作用不同时间（分别为即刻和24h）,用带电子拍摄功能的倒置荧光显微镜观察活细胞生长情况并