斑节对虾tlr22及relish基因的克隆与表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M090101053上海海洋大学硕士学位论文题目：斑节对虾TLR22及Relish基因的克隆与表达分析CloningandExpressionAnalysisofTLR22英文题目：&RelishgenesinPenaeusmonodon专业：水产养殖研究方向：海洋生物分子生物学姓名：刘文静指导教师：江世贵研究员上海海洋大学，上海，201306中国水产科学院南海水产研究所，广州，510300二O一二年六月二日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道

2、德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位

3、论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注主席委员委员委员委员委员委员秘书答辩地点南海水产研究所答辩日期上海海洋大学硕士学位论文斑节对虾TLR22及Relish基因的克隆及表达分析摘要斑节对虾(Penaeusmonodon)是我国重要的海水养殖经济品种。近年来，疾病爆发

4、、种质资源退化和养殖环境污染导致对虾在养殖过程中出现高死亡率，造成了巨大经济损失，成为制约对虾养殖业可持续健康发展的瓶颈之一。因此，从斑节对虾免疫系统入手，发掘和分析免疫相关的基因，研究其免疫调控规律，探讨其抗病机理，提高虾体抗病能力，并为进一步筛选抗病基因，从基因水平进行品种改良提供理论依据。本研究克隆了免疫信号通路的关键因子—TLR22基因和Relish基因，并探索其表达调控机制。同时，本实验还对Relish基因在斑节对虾发育过程中的作用进行了初步研究。TLR22是Toll样受体家族中重要的

5、一员。Toll样受体的发现是20世纪以来宿主天然免疫系统的最大进展。Toll属于模式识别受体(PRR)，通过胞外区的LRR结构域特异性识别病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)，启动细胞内信号转导通路，诱导干扰素、炎症因子等抗炎症因子表达。获得斑节对虾TLR22(以下简称PmTLR22)基因为3680bp，包含3045bp的ORF，可编码1014个氨基酸。PmTLR22蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。其胞外区含有12个亮氨酸重复

6、(LRRs)，胞内具有相对保守的Toll/白介素1受体结构域（Toll/IL-1R,TIR）。PmTLR22胞外的LRRs在第4个亮氨酸残基（L）高度保守。TLR22在进化上更趋于TLR3。实时定量荧光PCR显示在所检测的11种组织中，PmTLR22的mRNA在肝胰腺的表达最高，其次为肠、胃。使用定量PCR检测肝胰腺PmTLR22在不同免疫刺激条件下的mRNA表达情况，结果显示肝胰腺TLR22可被白斑综合征病毒（WSSV）和创伤弧菌诱导表达，而金黄色葡萄球菌不能诱导该基因表达。其中WSSV感染2

7、4h，PmTLR22显著上调表达23倍，创伤弧菌感染后6h和9h显著上调PmTLR22表达。进一步，证明了病毒核酸类似物Poly（I:C）及R484均可激活PmTLR22的表达，说明病毒PAMP对PmTLR22具有诱导表达作用，PmTLR22可能是识别PAMP的模式识别分子。获得PmTLR22胞外段的重组融合蛋白，其大小约为58kDa，为进一步研究其功I上海海洋大学硕士学位论文能提供基础。Relish是NF-κB家族成员之一。Rel/NF-κB是大部分信号转导的中枢，调控机体的先天性免疫应答、炎

8、症反应、细胞增殖和分化、细胞凋亡等重要的病理和生理过程。本研究在构建的斑节对虾肝胰腺cDNA文库中克隆得到NF-κB的家族成员之一Relish，命名PmRelish，其全长5112bp，包括3561bp的ORF，推测编码一个含1186个氨基酸的蛋白。PmRelish的蛋白具有Rel/NF-κB蛋白家族的典型结构特征，包括N端的RHD结构域，核定位信号，C端的6个锚蛋白重复序列以及死亡结构域，表明该蛋白是NF-κB1亚型。同源性分析显示斑节对虾PmRelish与凡纳滨对虾LvRelish及短小亚型