mr示综骨髓干细胞靶向大鼠肝癌的实验研究

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1、河北医科大学博士学位论文MR示综骨髓干细胞靶向大鼠肝癌的实验研究姓名：王琦申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：王士杰201204中文摘要MR示踪大鼠骨髓间充质干细胞靶向肝癌的实验研究摘要第一部分骨髓间充质干细胞的培养、纯化及扩增目的：本部分建立分离、纯化、培养、鉴定、扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。为以后的实验做好准备。方法：利用贴壁筛选的方法从Wistar大鼠骨髓中分离培养BMSCs并分析其基本的生物学特性。分析其形态特征和增殖特点。使用流式细胞仪验证细胞表型CD34、CD45、CD29、CD44特异性分子的表达以及向脂肪细胞、骨细胞分化的潜能。结果：原代B

2、MSCs呈纺锤样，主要以集落生长为主。传至3代，细胞的均质性明显提高。流式分析MSC不表达CD34和CD45，高度表达CD29、CD44。阴性对照组IgG2a．FITC署NIgGl。PE均取得相应的阴性实验结果。结论：我们成功地分离、培养及扩增了大鼠BMSCs，并对其进行了鉴定，达到了实验目的，为下一步的研究奠定了基础。第二部分超顺磁性氧化铁微粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究目的：探讨不同浓度超微超顺磁性氧化铁微粒(USPIO)与多聚左旋赖氨酸(PLL)标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的磁标记效率及对细胞生长活力的影响，寻找最佳配比浓度。方法：本实验设立7个研究组

3、。空白对照组的检测管仅含有未标记的BMSCs(A组)。按照PLL的有无及PLL浓度梯度(终浓度为0．25、O．5、O．75及1．Opg／m1)分为5个实验组(B．F组)；其中每个实验组再根据不同浓度Fe离子分为1．4个实验管(USPIO的终浓度分别为25、50、100、150pg／m1)。USPIO与PLL混合制备USPIO．PLL复合物。将不同浓度的USPIO。PLL复合物与培养基混，加入BMSCs孵育过夜。对照组A及实验组B—F组细胞标记后36h，取标记细胞数1×105个，重悬于0．5mlEpendoff管中。将24支实验管放入一内含琼脂糖凝胶的塑料模型中，采用1．5T

4、M砌扫描。扫描序列包括TlwI、T2WI和SM。测定各序列信号强度，并使用方差分析做统计学分析。细胞活力的测定采用台盼蓝排除试验。细胞生长的观察采用MTT法。使用电镜观察标记后的BMSC及细胞内的SPIO微粒。使用火焰法测量中文摘要细胞内铁的含量，判断铁含量与MR信号的关系。结果：镜下观察B．F组标记细胞仍保持干细胞原有形态，胞质内均可见普鲁士蓝染色颗粒。随标记浓度的增加和PLL的使用，细胞内蓝染颗粒增多。电镜下观察SPIO．PLL混合物标记后的干细胞其内的铁离子聚集成团，粒径多在10～20nm之间。而仅有SPIO标记的干细胞其内铁离子数量较少，分布稀疏，很多铁离子没有集聚

5、呈团。A．F组台盼蓝染色细胞活力分别为99．20％4-1．11、97．41％士3．42、96．32％4-3．67、97．24％4-4．34％、95．43％4-3．33和93．43％4-5．33。显示90％以上的细胞均拒染台盼蓝，可见经铁离子标记后的BMSCs保持较好的细胞活性。细胞浆内的铁离子对细胞的影响较小。根据各组细胞的生长曲线判断单纯使用铁离子浓度达至J200pg／ml时对细胞的生长有抑制作用；使用1．0pg／mlPLL同样会对细胞的生长产生一定的抑制作用。火焰法测得单独SPIO标记细胞与SPIO+PLL标记细胞细胞相比有显著差异(P

6、剩余量有显著差异。TlWI、T2WI及SWI各序列扫描提示各组间均有显著性差异(P值均

7、2cm的塑料模型。体模模型内充满2％琼脂糖胶。实验使用8支EP管，其内分别含有单纯PBS溶液、10、20、30、40、50、60、7099／ml的SPIO混悬液(A．I组，A组为对照组)。采用Siemens及GE1．5T两种MR仪，扫描序列包括T1WI、T2WI、T2*、HASTE、SWI、ESWAN幂HR2*。MR信号值组间比较采用方差分析。结果：各扫描序列对不同浓度SPIO均有信号强度的差异(P<0．05)。综合两种机器的各扫描序列信号值的变化及统计分析的结果，SPIO扫描的最佳序列为SiemensMR机的SW