oshsp82基因的克隆、分析及互作蛋白研究

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第一章文献综述1．热激蛋白研究进展1．1热激生理植物在整个生命周期中，都处在一个不断变化着的环境条件之中。适宜的环境条件能保证植物正常发育，但如果环境变化太过剧烈，超过了植物正常生长发育的范畴，就会对植物产生伤害。由于植物本身不能通过移动来逃避生长环境，只有改变自己的应对态势来适应环境。热激是指高温对植物造成的胁迫。植物遭受高温胁迫后，在外观形态上表现出多种症状，如：根系生长受到抑制，叶片茸毛、蜡质、角质层厚度、气孔数量和开度以及栅栏细胞的排列发生变化，叶片萎蔫，呈现水浸状，叶片由绿转为灰白色继而变黄，甚至出现死斑、褐变，树皮灼伤开裂，受伤处的组织形成木栓，花芽数减少，花瓣和花药枯萎失水，花序和子房脱落，配子异常而出现雄性不育等【l】。在分子层面表现有：蛋白质变性，由于维持蛋白质空间构型的氢键和疏水键的键能较低，破坏蛋白质的空间构象，失去二、三级结构，使蛋白质分子展开，失去原有生理活性，膜脂液化，构成生物膜的蛋白质与脂类之间的大键断裂，使脂类脱离膜而形成一些液化小囊泡，从而破坏膜结构，导致膜丧失选择透性与主动吸收等特性【2J。植物在高温胁迫下的生理反应则主要有：有毒物质大量积累，植物组织内氧分压降低，无氧呼吸增强，从而积累乙醛、乙醇等有毒物质，高温可降低SOD等酶的活性，从而使植物体内活性氧及自由基代谢系统失衡，蛋白质合成受阻，降解加速，导致生长受抑制。1．2热激蛋白的发现giotssa在l962年发现果蝇经过热激处理后出现了一种新的唾液腺巨大染色体膨突模式【31，并伴随着新蛋白的合成。由于是在热激条件下产生的蛋白质，故将其命名为热激蛋I刍(heathsockporetn，Hsp)【4】。直至U1978年才证明热激蛋白广泛存在于其他生物中，而且他们在几乎所有的活细胞中都起着重要的作用【5J。关于植物的Hsp，其广泛而深入的研究始于20世纪80年代初。研究者们发现，一些生长在温带的植物如大豆、玉米、甜椒和豌豆等，当组织温度超过32．33℃时就开始合成HSP，而且HSP的合成随温度的升高而增加【6】【7】。一些研究表明，热激蛋白的诱导因子不仅局限于高温，其他环境胁迫也可以提高它的含量。Ristic等【8J发现抗干早和高温的一个玉米品系可以大量合成一种45kD的热激蛋白，而对干早和高温敏感的品系则不能合成。Celler等p】指出，植物在干旱情况下合成的脱水应答蛋白(dehydrins)中的一个亚类属于LEA(1aterembryogenesisabundantprotein)蛋白家族，而与低分子热激蛋白具有很高的同源性。 陈忠等‘101的研究表明，PEGn--]以提高Hsp60的表达水平，其最强诱导能力与38"C热激相近。除此之外，砷化物、高盐以及氧化剂和辐射胁迫都可以诱导热蛋白的表达ll¨。随着研究工作的进展，发现Hsp已经不仅仅是在高温下暂时保护细胞的作用【l引。一些热激基因在无刺激的细胞中也有明显的表达【13】，或是在生物体发育的某些阶段表达‘141，或是在细胞周期的特定阶段产生，这种在无热激条件下也表达的热激蛋白质基因家族成员通常被称为Hsc(组成型表达的Hsp)。关于这些基因的功能还有待进一步更加深入研究。1．3热激蛋白的分类植物Hsp的种类很多，通常根据分子量(kD)的大小，将其分为高分子量(>50kD)热激蛋I刍(HighMolecularWeightHsps，简称：HMWHsps)和低分子量(<50kD)热激蛋I刍(LowMolecularWeightHsps，简称：LMWHsps)两大类。而植物Hsps[拘特点是低分子量Hsps丰富。已知在高等植物中，有20多种LMWHsps存在【l51。一般将植物热激蛋白按分子量大小细分为几个家族：Hspl10(>100kD)，Hsp90(80～90kD)，Hsp70(66～78kD)，Hsp60(50-60kD)，sHsps(15-39KD)。1．4热激蛋白的功能1．4．1热激蛋白的保护作用热激条件下，植物体内合成大量的Hsp【l61。热激后大豆I类低分子量Hsp的含量可达到细胞总蛋白的1％以上，并且和耐热性是成正相关【17J。Lee等【l8】通过转基因技术表达拟南芥的热激转录因子，它可以诱导细胞质I类低分子量Hsp组成型表达，而提高耐热性。Lee等发现，当Hspl01的反义RNA转入拟南芥中，在降{氏Hspl01的表达的同时，也降低了拟南芥的耐热能力【I引。在烟草中过量表达番茄线粒体sHSP可提高烟草的耐热能力【20】。Jofre等指出，Hsp的抗热性与细胞内的可溶性蛋白质的稳定性有关口¨。热激下大豆细胞形成高度有序的结构复合体，至少有15种15．18kD的细胞质I类低分子量Hsp组成【221。尽管水稻、绿豆、豌豆中合成的低分子量Hsp的数量不同，等电点和分子量不一样，但都形成大小相近的270．310kD的复合体。这种复合体有高度的热稳定性、不受高盐浓度和表面活性剂的影响，推测这些特性可能与耐热性有密切关系【231。大豆、绿豆、和水稻细胞中富含低分子量Hsp的组分，它们具有维持蛋白质热稳定性的作用。而且。从大豆富含Hsps的组分中除去15．18kD的Hsp，则热稳定性丧失，加入纯化的280kD的细胞质I类小分子量Hsp复合体，这种保护作用又恢复，说明不同种类的植物所含Hsp组分可以互相替代，行使热稳定作用。热激时，Hsp形成约40nm的大颗粒结构，这些颗粒由5．10％的Hsp70和50．80％的小分子量Hsp组成。非热激条件下，在亚砷酸盐或氨基酸类似物诱导HSP合成的同时，也形成细胞质I类小2 分子量HSP复合物。这些研究都说明]"Hsp和植物的耐热性有关。人们在研究植物Hsp的早期就已经注意到低温诱导合成的某些蛋白可能与热激处理诱导产生的蛋白有关【24J【25】。后来对冷驯化和热激期间合成的蛋白进行了比较，认为它们诱导合成明显不同的蛋白质，但电泳结果表明它们却很相似。进一步用蛋白质印迹法分析受冷激的玉米，发现其积累-j"Hsp，并且既有高分子量的也有低分子量的。这种现象也在大豆、菠菜中得到证实。编码27kDHsp的RNA含量在冷激处理的大豆中提高，且菠菜冷驯化过程中积累的分子量为79kD的蛋白质与Hsp有很高的同源性。由此可以看出，虽然热激反应和冷驯化涉及不同的适应性反应，诱导产生自己独特的逆境蛋白，但这两种不同的反应也与一种共同的逆境蛋白有关。随着研究的深入，低温诱导Hsp的现象得到了进一步证实【26】。在马铃薯中观察到低温处理可以导致小分子量Hsp转录物的积累，这些蛋白能以没有ATP参与的方式重新折叠变性蛋白。Collins等【27】首先证实了冷敏感植物和组织的耐冷性与热激蛋白的关系。绿豆下胚轴在热激(40℃，3小时)下，可以诱导Hsp70幂HHsp79的新合成，并可减轻随后的冷胁迫(2．5"C)对膜的损伤，使溶质渗漏减少，增强了组织的抗冷性，但在6．9天后，热激诱导的抗冷性消失。对番茄的研究表明，番茄中tom66基因和番茄叶绿体低分子量Hsp基因(tomlll)的表达与番茄抗冷性的增强有关。在甘蓝型油菜中发现一种Hsp90基因可被低温诱导，水稻Hspl10也可因低温处理而积累。菠菜低温应答过程中除THsp70家族的积累外，Hsp90也能被诱导。推钡,qHsp的功能可能是单独或是与其它Hsp构成复合体，并参与运输冷驯化中合成的多肽到质膜、核或细胞器中。另外，低温会促进蛋白质变性，Hsp可能具有稳定功能的作用。植物遭受高温、低温、水涝等胁迫时，体内产生活性氧，当植物本身的活性氧清除系统不能将其及时清除时，则造成活性氧伤害。热激蛋白具有分子伴侣作用，逆境条件下对蛋白质具有保护作用，如在强光引起光抑制和光氧化胁迫时叶绿体sHsps可以保护PSII。叶绿体是产生活性氧的主要细胞器【2引，因此叶绿体sHsp可能对光氧化。胁迫造成的伤害有防御作用。热激处理番茄幼苗，其叶绿体的sHsp组成型表达可以减轻光氧化伤害【29】。Lee等1301禾U)$JH202处理水稻幼苗诱导叶绿体sHsp的合成，认为H202可能作为信号物质诱导该基因表达。这些研究结果表明Hsp通常在植物受到氧化胁迫时有助于提高植物的抗氧化能力。1．4．2热激蛋白在植物发育中的作用高温诱导Hsp表达的现象在具有转录活性的大部分植物组织中都存在，热激基因的转录和Hsp的合成在所有营养组织中都会发生，包括半成熟的种子、吸涨种子的糊粉层和发芽的胚胎。完全不对热激发生反应的两个发育阶段是胚胎发育早期的前鱼雷期和花粉萌发时，虽然不能激活Hsp基因，早期的胚胎仍然能合成明显数量的Hsp。显然，胚胎中己经存在了处于翻译活性状态的Hsp的mRNA。植物中某些HSP的表达3 是具有组织和发育的特异性的，sHSP不仅在胚胎发生早期时存在，而且在豌豆和甜椒种子中也有细胞质sHSP的第1类成员，第1I类成员的mRNA在未受高温刺激的玉米和百合的大孢子发生这一特殊发育阶段的表达也被检测到p¨。现在认为，Hsp对胚胎干燥的耐受或者对种子重新吸水萌发都是必需的。一些研究表明，热激蛋白在发育过程中的表达可能受发育程序控制，而与胁迫信号无关。但关于热激蛋白调节发育表达方面，仍然有很多问题有待进一步研究。在豌豆中分离到3个Hsp70的eDNA克隆，Hsp71．2，Hse71．O和Hsp70，Hsp71．2的mRNA在发育中的豌豆种子的合子器官中能够检测到，而种子的母本器官(例如种皮、果皮、苞叶)中则没有；Hsc71．0矛lHsp70b的mRNA在以上两类器官中都存在。陈建南等㈣将Hsp701瓶．义RNA注射处于花粉母细胞时期的高粱3B的幼穗底部，Hsp70的反义RNA进入可育花粉后抑制了花粉的正常形成，使可育花粉变成了不育花粉。后来也有实验表明Hsp和植物的花器官的发育密切相关【33】。另外，Hsp与种子活力有关【34。。豌豆种子发育过程中，细胞质I、II类sHsp受发育调控，在于种子中检测至lHsp17．4和Hspl7．6135】，Almoguera和Jordano136l在向日葵的干种子中检测到了Hspl7．6。在甜椒胚中也发现具有发育依赖特性的Hsp，它们可能与种子耐脱水性、胚发育、休眠、萌发、耐热性、寿命形成及维持都有密切关系【”】。Nieto．Sotelo等【38】利用免疫化学的方法在成熟的玉米种子和萌发的种子中发现有Hspl01的积累。到目前为止，尽管关于发育过程中Hsp的表达与调节机制还不十分清楚，但是，Hsp在发育过程中具有重要功能是不容置疑的。1．4．3分子伴侣功能蛋白质的折叠、组装是一个复杂的生物学过程。在此过程中，常常需要分子伴侣(Molecularchaperone)的参与。分子伴侣(molecularchaperones)是指与新生肽链的折叠，寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输有关的一类蛋白质分子。Hsp60最早被称为分子伴侣，目前已经证明Hsp90，Hsp70都具有分子伴侣作用。研究发现，正常情况下Hsps可从3个方面来维持和保护新合成蛋白质的伸展状态：(1)防止新合成蛋白质的错误折叠或聚集；(2)允许其穿过生物膜；(3)使蛋白质正确折叠并形成寡聚体，在应激状态下，Hsps可防止其它蛋白质发生变性或解烈261。Hsp70是细胞内的分布最广、含量最丰富、最重要的一类分子伴侣，参与细胞内多种蛋白质构象改变过程。研究证实在细胞内多种新生蛋白质分子的定向移位，以及穿过亚细胞膜的过程，都需要Hsp70及其相关蛋白质的参与。正常状态下的细胞中，新合成的多肽从核糖体大亚基的通道中一进入细胞质，就与胞质中的Hsp70结合，直至多肽链合成终止；然后Hsp70乖lJ用ATP水解的能量促进多肽折叠成正确的三级结构或装配成蛋白寡聚体并释放底物蛋白。如果底物蛋白是定位于细胞器中的，Hsp70就会维持新生多肽的伸展状态并在其它因子的参与下完成多肽的跨膜运转，细胞器中的 Hsp70将与Hsp60协同作用促进多肽的折叠和装配139】。Hsp70蛋白中研究最多的是植物内质网BiP蛋白(在哺乳动物细胞中它可以与免疫球蛋白的重链结合而称为结合蛋白，简称BiP)。Galili等1401发现在大量合成贮藏蛋白的胚乳中BiP量很高，在其它组织中BiP含量很正常，说明BiP的表达量与蛋白质合成与组装的要求是一致的。Hsp60也是一类重要的分子伴侣。线粒体Hsp60主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。当某种蛋白进入线粒体后，首先以未折叠的状态与Hsp60形成分子复合体，通过Hsp60分解ATP提供的能量进行折叠。己折叠的蛋白的释放需要ATP以及其它的线粒体蛋白因子的参与。叶绿体Hsp60同源物最初称为Rubiso连接蛋白，由核基因编码，在非热激条件下含量很高，目前尚未有热激诱导其表达的报道。豌豆离体Hsp60由分子量约61kD和60kD的两种亚基组成的复合体，主要参与Rubiso全酶的装配。植物Rubiso全酶由2类16个亚基组成，8个由叶绿体基因编码的大亚基和8个核基因编码的小亚基，新合成的大亚基首先和Hsp60结合才能装配成全酶。总之，Hsp60年NHsp70在其它低分子量Hsp的参与下可以共同作用，参与蛋白质折叠的过程。Hsp70在蛋白质跨膜进入细胞器的过程中使输入的蛋白处于未折叠的状态，将它们转移给Hsp60然后Hsp60开始对这些蛋白质进行折叠和装配M¨。近年来发现，Hsp90在体外可作为通用分子伴侣起作用。在体外它可以防止激酶的凝集、启动己凝集的蛋白质解凝集，使激酶的活性提高20倍。在热激和热激恢复时，15．18kD的Hsps会在细胞质和细胞器之间穿梭，起着分子伴侣的作用，具有保护细胞不受高温伤害，修补损伤蛋白质的作用【421。1．5热激蛋白基因的表达调控真核细胞Hsp基因的转录调节过程包括热激因子(heatshockfactor，Hsf)的激活，Hs屿热激元件(heatshockelements，Hse)的结合及Hsp基因的转录3个步骤。植物HspmRNA的快速积累主要是由Hsp基因转录水平提高所致H31。经热激而活化的热激因子Hsf(heatshockfactor)可识别存在于Hsp基因上游启动子区域的热激元件而诱导Hsp的转录。常温下，Hsf以单体形式与阻遏蛋白女HHsp70相互作用，而不能结合至UHSE上。热激时，错误折叠的和凝集的蛋白质与Hsp70竞争结合Hsf，解除了抑制Hs卿DNA结合的因素，nsL幺t装成具有DNA结合活性的三聚体并结合到Hse上，激活热激基因的表达。合成的热激蛋白包括Hsp70，当Hsp70积累到一定程度又和HsLt'3d合，使其回复非活性的单体形式，Hsf年IHse分离，转录停止。一些研究者认为Hsp70本身可作为感温计，而细胞通过它感受特定的代谢失调ml。在非胁迫条件下Hsp70与Hsf结合，从而抑制Hs啪活性；在胁迫状况下胞内异常蛋白增多，Hsp70结合到折叠蛋白上，使Hsf释放出来。之后，Hs￡进入细胞核，形成有功能的多聚体，并与Hse结合而启动Hsp基因的转录。胁迫解除后，Hsp70重新与Hs瞄合，关闭Hs啪活性。热激可以改变受刺激细胞的翻译机器，从而使细胞倾向选择HspmRNA而不选择 非HspmRNA进行翻译【451。植物的不同发育阶段对HspmRNA也表现出选择作用146。。Kaliask1471发现，大_豆_@Hsp70的mRNA量在不同组织、不同发育阶段以及每天中不同时间内变化很大，但反映在蛋白质水平上的波动则很小。所以，Hsp的合成在某种情况下受到翻译水平的调控。有研究发现，Hsp701拘表达调控与ATP有关，Hsp70家族的所有基因在N末端含44kD的ATPase保守区域，在C末端含有15kD的多肽结合位点，ATP结合Hsp70上，形成的结合产物较ADP结合物亲和性低。因此，可能由于ATP与ADP间的相互转化而实现了对Hsp的调控。2．Hsp90家族及其结合蛋白研究进展2．1Hsp90家族Hsp90家族是一类分子量为90KD左右的热激蛋白，它具有帮助蛋白质折叠，保持蛋白质结构完整，调节胞质蛋白亚群表达等功能。Hsp90家族基因被从进化上不同的生物中包括果蝇、酵母、鸡、哺乳动物、椎虫、细菌等纷纷克隆和测序。对基因测序的结果显示Hsp90家族基因具有很高同源性。真核生物中相差最远的都有50％氨基酸同源，即使与大肠杆菌比较也发现超过40％同源性【4引。在所有真核生物中的Hsp90都含有一个几乎没有同源性但具高密度负电荷的区域，这个区域在蛋白质中都处在相同的位置，但大肠杆菌不含这区域。所有生物中都在C端具有另一个高负电荷的小片段，不过除去最后四个高同源的EEVD序列外，其他的氨基酸构成上存在差异，说明此序列在热激蛋白功能行使中有着特殊意思。研究发现Hsp90是包括酵母【49】、秀丽线虫【50l、和果蝇【5ll在内的许多真核生物生存所必需的，而Hsp90表达量较低或突变的细胞对胁迫高度敏感【521。事实上Hsp90家族蛋白在正常的生长状态下也有大量存在，在果蝇中只有一个Hsp90家族蛋白Hsp82t53】。Hsp82既是组成型表达又能被热和其他胁迫所诱导【”J。而在发芽酵母中有两个该族蛋白，一个是Hsc82，高水平的组成型表达也能被热激轻微诱导；另一个是Hsp82，低水平的组成型表达，但是能被热激强力的诱导。在果蝇、酵母以及脊椎动物家族中均发现Hsp90家族在正常温度下主要在细胞质中以可溶的形式有大量表达，而在热激过程中从细胞质中转移到了细胞核中【55】。在多细胞生物中，Hsp90家族蛋白在内质网，线粒体内也有存在，甚至在植物叶绿体中也有存在，但多数的研究还是针对在胞质中存在的Hsp90蛋白。许多分子伴侣都有协助蛋白质折叠【56。，但Hsp90与其他的伴侣有两方面区别，其一是Hsp90并不帮助新生蛋白的折叠，而是在其底物即将完成折叠的接近活性状态时结合(图1)陋。7】；其二是Hsp90与底物的结合是乎有特异性，其结合蛋白大多数是参与了信号转导的。Hsp90通过防止未完成折叠蛋白聚集的方式保证蛋白质正常折叠。同样地，Hsp90矛tl已完成折叠的蛋白质形成更稳定的形式保持其构象和防止聚集。早在研6 究70～80S的类固醇复合物时，就发现Hsp90能起到维持功能区域活性的作用【58】。进一步的研究发现Hsp90能独立地完成防止错误折叠的蛋白聚集和分离已聚集的底物的作用【591。而Hsp90蛋白和未折叠蛋白的结合可能是和其他分子伴侣的协作‘601，同样地，在修复或去除变性蛋白时，Hsp90成为Hsp70的竞争结合物，从而间接的结合到变性蛋白上⋯。娜Q懋≠国f飘翁lt秽ein穗ctiveprotein图1Hsp90与新生蛋白的结合Fig．1TheinteractionbetweenHsp90andthedenovoproteinmostproteins2．2Hsp90家族功能域一直以来对Hsp90功能域的研究并未停歇，近年来也开始运用点突变来研究Hsp90功能，但直到现在尚未有关于Hsp90区域结构、结合表面和结构的完整结果。而一般来说，Hsp90家族蛋白质能够被分成3个区域(图2)：N端的ATP结合和水解位点、中间区域和C端区域。N端约220氨基酸构成的区域具有ADP／ATP、Hsp90抑制剂格尔德霉素和根赤壳菌素的结合位点162。。但与其他分子伴侣和激酶的ADP／ATP结合方式不同163j，Hsp90ATP结合位点的ATP酶活性较弱晔】，C端的序列对于ATP水解活性的维持和促进有重要作用【651。由于人Hsp90的一个底物可以大幅提高其ATP酶活性【66】，有种猜测是C端的序列可能充当了假底物进而促进ATP酶活性。紧接到N端ATP酶区域，是所有的真核胞质Hsp90都含有一个具有大小略有不同电荷的中间区域【671，对变性蛋白有高亲和性，也提供了一个共因子的结合位点。最后在C端包含二聚化作用区域和所有真核生物胞质Hsp90都含有的MEEVD氨基酸序列。这个多肽片段构成了HSP907 与其共伴侣TPRs序列结合的核心【681。最近的研究发现，在C端有第二个ATP结合区域【691，它会在N端ATP位点发生结合后开启【70】。CamforbbdingI"PRproteinsDlmerlzatlonChaperoneactivityChaperoneactivityGeldanamycinbindingATPbinding?’Novobioctnbinding图2Hsp90功能域结构Fig．2ThefunctiondomainofHsp90AAHsp90家族通常是以依赖ATP的Hsp90-"聚体作为核心的伴侣复合体行使其功能的，分子伴侣活性需要依靠ATP结合和水解功能，因为ATP结合和水解被认为是控制Hsp90二聚体N端分子钳的开关从而改变构象的171】，二聚体分子钳的额部就在N端，而由C端的的二聚体区域将分子钳二聚体连接在一起，中间区域结合底物蛋白(图3)阮73】O2．3Hsp90家族结合蛋白Hsp90的结合蛋白主要包括三类：共分子伴侣，调节分子和底物，但并没有太严格的区别。Hsp90的共分子伴侣类型也有所区别，主要在结合方式，对Hsp90ATP．ADP循环和底物结合的影响三方面。大多数的共分子伴侣都有TPRs序列，并通过Hsp90C端的MEEVD结合，而Hsp90的其他序列会调节这种结合【_74】。这类包括Hop／Stil，亲免疫因子FKBP5l、FKBP52、遍在蛋白40，蛋白质磷酸酶5，AIP，酵母Cnsl蛋白，果蝇Dpit47蛋白，CHIP，肌球蛋白结合蛋白UNC一45等等【_75J。共分子伴侣之间是相互独立的I_76】，在某一特定时间，主要和某种特定的TPR蛋白结合，而这也对应某些功能。CHIP和Hsp90结合时导致结合底物遍在蛋白化和分解177。。Hsp90怎样调节这种结合，是否得益于其他共分子伴侣的帮助现在还未知。p23／Sbal是个自身具分子伴侣活性的酸性小蛋白【78】，它与Hsp90的N端结合。这种结合需要ATP结合和二聚体化【791，因而会被Hsp90抑制剂格尔德霉素和根赤壳菌素㈣以及Hop／Stil抑制【8l】。Hop通过其两个TPR序列与Hsp70、Hsp90组成复合体瞵2。，而ATP币Np23驱动-]"Hsp90在没有Hop的情况下形成异源的复合体。对糖皮质激素受体作为一个模板底物的研究中发现，Hsp90和Hsp70能够8 充分的保证其证确的折叠，而Hop、Hsp70伴侣Ydjl和p23能够分别加速，确保和维持底物的折叠【”I。p23的精确作用还不得而知，但是己知它能和多种的成熟Hsp90-底物异源聚合体结合【洲，他的这种结合可能仅仅是加速底物的释放而已¨”。Cdc37／Harc可能是特殊Hsp90底物的共分子伴侣畔I。Cdc37可能是Hsp90和激酶结合的特异共分子伴侣日”。虽然Cdc37和Hsp90结台的具体位点还未得到确认，有中观点认为Cdc37和TPR蛋白结台在相邻位点口”，更多的证据发现Cdc37和TPR蛋白能存同一个Hsp90异源复合体中存在，甚至他们能直接结合¨w。N噩罔3Hsp90二=．聚体结构Fig3ThemodelofHsp90dimer*色部分为Hsp90N端，绿色邾计为№p90c端，n色为HsP90中问E域．金乜部分为低物沓山．头色郝分为Jt分r件僻。越来越多的证据$正U)tHsp90的功能受磷酸化调节。Hsp90需要由醅蛋白激酶II磷酸化和再次磷酸化来促进受亚铁血红索调节的抑制卉IJHRI功能的行使【州。而对于Hsp90的其他底物，如pp60v．src[⋯Ⅷ呼肠病毒Ⅱl[q21，Hsp90酗J磷酸化可能导致底物的释放。有证据表明酵母的蛋白激酶Bsch9行使Hs口90的功能抑制剂的角色删。已知大量的Hsp90蛋白的日标蛋白都有参与信号传导和细胞周期控制。尽管已知的研究结果有些片面，但也初步形成了一个假说：Hsp90伴侣复合体的作用可能是辅助功能调节的相关结构域M1。而这种辅助主要是通过两个方面，一个是通过Hsp90的结合确保底物在信号不存在时保持兀活性状态，而适当信号能诱发底物的释放进一步完成折叠；二是在信号导人后帮助晟后的折叠，完成并保持构象。事实上，酵母StelI口1和B一半乳糖苷酶M15片段m1的折叠和构蒙的维持都需要HsD90的帮助。同样的，src家旅也需要Hsp90帮助新生蛋白再整合到细胞膜上之前的折叠删。除了这种帮助折叠的基础作用外，lisp90也是双链活化激酶PKR的抑制物，它使得pKR以完全折叠的无活性状态存在，而GA诱导能足够让PKR释放并恢复活性『9”。类同醇受体也受类似调节。而对于Apaf-I，Hsp90阻止其由细胞色素c介导的寡聚化作用【矧，但Hsp90可以促 进某些端粒酶【1吲，和B型乙肝病毒逆转录酶与核糖体复合物的聚集【1011。PDKl的信号传导下游Akt需要Hsp90帮助不被去磷酸化成无活性状态1102】。虽然Hsp90底物数量还在增加，但人们对底物与Hsp90如何识别还知之甚少。Hsp90可以与未折叠的中间体结合，而Hsp90的几个功能域是乎具有独立的底物识别特征。在发芽酵母的实验中发现，许多蛋白在正常生理条件下并不需要Hsp90辅助折叠，但在逆境胁迫下，发现越来越多的蛋白需要依赖Hsp90辅助恢复活性Il叫J。3．本实验的目的和意义热激蛋白做为一种应激蛋白，最初被发现能为热激所诱导，而后发现能被低温、高盐、重金属离子、生长激素等诱导，多变的诱导条件说明了热激蛋白参与着生物自身调节的方方面面。Hsp90作为热激蛋白家族中重要的一类，通过与大量的共分子伴侣、调节因子和底物结合，调节着细胞周期与细胞信号传导。目前对于Hsp90的研究更多的集中在果蝇、酵母等模式生物和哺乳动物，但也并未对Hsp90参与信号传导及其分子伴侣作用有全面、透彻的研究结果。而在植物中，尤其是水稻Hsp90家族的研究更少。基于Hsp90家族对于植物抗逆和信号传导方面的重要作用，本实验通过RT-PCR技术分析从FDD得到的水稻Hsp82在高温和低温下的调控表达模式，并运用酵母双杂技术，以干旱和低温处理的材料构建cDNA文库，以水稻Hsp82为诱饵蛋白，筛选水稻中的结合蛋白，希望能发现参与其信号传导的分子和作用蛋白。通过研究结合蛋白，进一步分析和揭示Hsp90家族在信号转导、分子伴侣等方面的作用，并希望能填补水稻Hsp90家族研究的空白。lO 第二章．OsHsp82的克隆及表达分析l、材料与方法1．1植物材料水稻品种日本晴(OryzasativaL．subsp．japonicaCV．Nipponbare)种子在浸种，催芽之后，播种在石英沙中并用(1／10)MS无机盐溶液浇灌，于25"C下培养至3叶期。取无伤幼苗进行热激(42℃)、冷激(8oc)处理。取热激和冷激处理0min(对照)、15min、30min、1h、2h、4h、8h和12h时幼苗的叶鞘和根分别在液氮中速冻后置于-80。C冰箱中保存备用。1．2方法1．2．1RNA提取一、器皿准备所有器皿均需在120℃条件下高压灭菌40分钟。二、试剂准备l、盐酸胍变性缓冲液配方：盐酸胍8MMes20mMEDTA50mM巯基乙醇50mMpH7．0●Mes：4一morpholineethansulfonicacid(4-吗啉乙磺酸)；●Mes可以与EDTA混和配制，盐酸胍必须现配，巯基乙醇单独配。2、苯酚先用2MTris／HCl，pH8．0饱和两次，然后用O．1mMTris／HCl，pH8．0保存三、试验步骤依据用盐酸胍．酸酚法提取各处理的水稻叶片和根的总RNA。1．取植物材料于研钵中，加液氮迅速研磨成粉末状；2．加入2体积的盐酸胍变性缓冲液，混和均匀，室温下解冻，并注意混匀；3．加入0．5体积的苯酚：氯仿：异戊醇=25：24-l溶液，震荡混匀，4℃条件下，11000rpm离心20min：4．取上清液，加入O．8体积的苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1溶液，混匀后4℃条件下，11000rpm离心20mira5．取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1溶液，混匀后4℃条件下，11000rpm离心20min： 6．小心汲取上清液，加入0．2体积1．0M醋酸(乙酸)和O．7体积乙醇，混匀沉淀RNA，然后在．20℃过夜或．70℃静置1．0h；7．4℃条件下，11000rpm离心10mira8．弃上清液，室温下用灭菌3M，pH5．2醋酸钠清洗IⅢA沉淀数次；9．4℃条件下11000rpm离心10min；lO．弃上清液，用70％酒精洗涤RNA沉淀去盐；用100％酒精脱水，室温干燥，．80℃保存。1．2．2RNA纯化用LiCI沉淀法纯化RNA，配制100ml10M的LiCI溶液，用DEPC处理的超纯水溶解，高压灭菌后冷却备用。1．取出．80℃保存的RNA沉淀，溶于60p,lDEPC处理的超纯水，混匀；2．4℃，11000rpm离心2min；3．取上清液，剩余沉淀再溶于50lxlDEPC处理的超纯水(步骤同1)；4．两次所取上清液定容为150“l，不足的用超纯水补足；5．在定容后的上清液中加入37．5“110M的LiCl溶液，使最后浓度为2M，混匀；6．冰上静止2h，4℃，13000～14000rpm离，t],60mini7．弃上清液，70％酒精洗2次，4℃，1100rpm离一t],10mini用100％酒精脱水，室温干燥，得到较纯的RNA，．80℃保存。进行RNA甲醛变性凝胶电泳，在确认RNA完整性后，再经DNase处理以消除DNA污染，供反转录用。1．2．3mRNA差异显示及基因片段克隆根据荧光差显试剂盒(Takara)合成cDNA和调制反应体系，9个锚定引物和24个可变引物进行组合使用在第l轮PCR反应中。PCR条件为：Stagel94℃1min94℃2min38℃5min72℃5minStage294℃30S38℃2min72℃lmin35cyclesStage372℃8min4℃oD(保存)12 反应结束后，加入等量Loading．buffer用7mol／L尿素PAGE(5．4％聚丙稀酰胺)进行分离，通过荧光扫描仪(BAS．3000，F吗iFilm)成像后，根据图像回收差异片段，于50此灭菌水中放置30min，煮沸10mind，上清液作为第2轮PCR反应的底物。根据第l轮PCR的锚定引物和可变引物扩增片段。其反应条件为：StagelStage2Stage394℃40℃72℃15cycles72℃10℃1min(预处理)30S2min1min3min∞使用含O．1％H．A．．Yellow(Takara)的尿素PAGE分离样品和回收荧光强度最高的主带，作为第3轮PCR底物，其反应条件除循环数增加到42cyclesP]"，其余与第2轮相同。反应后，每样品扩增产物的1¨l点在尼龙膜上，风干后进行紫外线固定处理(2min)，用于大矩阵(macroarray)筛选。使用3lagmRNA，通过M-MLVRT(Promega)酶合成dUTP．dig探针，筛选阳性克隆。余下的扩增产物，在2％琼脂糖胶上电泳、回收。使用玻璃粉(BIO101)纯化DNA片段。1．2．4感受态细胞的制备一、培养基和试剂LB培养基BactotryptonBactoyeastextractNaClAgarpowerPHSOB培养液BactotryptonBactoyeastextractN把1(5M)KCI(2M)PH高压灭菌后冷却至室温加入2MM92十1．25ml7．O10mlL垤ggDL畦-准m儿毗弛弛观加儿桃瑰m SOC培养液1LSOB培养液+10ml2M葡萄糖2MM92+(灭菌)2MMgS04．7H20+2MMgCl2．6H20TBbufferPIPES(10mM)CaCl2．2H20(15mM)KCl(250mM)PHMnCl2．4H201L3．0g2．2g18．6g6．710．9g所用试剂的浓度100mg／ml氨卞，100mMIPTG，20mg／mlX—GAL，2M葡萄糖液二、实验步骤1、取大肠杆菌JMl09菌种，接种子LB培养基上，在37℃倒置培养一夜。2、挑取LB平板上的约20个单克隆于250mlSOB培养液中，在25℃水浴振荡培养12一16h，使其OD600=0．4珈．8。3、培养好的菌液放置冰上1卜15min，并在4℃，6000rpm离一t],10min，弃上清液。4、加入84mlTB溶液(预冷)充分悬浮后，在4℃，6000rpm离心10min，弃上清夜。5、加入20ml冰冷TB溶液，缓慢加入1．5mlDMSO，在0℃冰上放置10min。6、分装到1．5ml的灭菌管中，每管装200gl液氮速冻后放入．80"C冰箱中保存。1．2．5DNA片段的连接按试剂盒说明，将纯化的DNA片段与pMD18T-vector(Takata)连接。1．2．6连接产物的转化l、取感受态细胞JMl09，an／ksgl连接反应产物，混合，冰上放置30min后，置于42℃水浴锅中热激45s，并在冰上放置3min。2、每管力nXsoc培养液lml，37℃下低速振荡(5卜60rpm)培养1h。14 3、3000rpm，离，612min，弃1ml上清液，其余悬浮。4、将悬浮液倒入LB／Amp+IPTG+X．GAL培养基上，用玻璃播菌杆推干刮平，于37℃倒置培养12．16h。1．2．7克隆的筛选以及阳性克隆的检测l、筛选：用牙签挑取白色单菌落，分别接种在LB／Amp平板培养基上(倒置培养，37℃)和O．5mlLB／Amp培养液中(振荡培养，37℃)一夜。2、质粒DNA的制备(溶菌酶法)①将在37℃LB／Amp培养液中振荡培养一夜的菌液，于10000rpm离心lmin，弃上清液。②沉淀加入100lalSTETbuffer和5“l10mg／ml溶菌酶，充分悬浮。③放入沸水中煮40s，溶液变成白色，14000rpm，离心10min，用牙签挑出白色沉淀。④加入等量异丙醇，充分混匀，于．20℃冷冻15min。⑤14000rpm，离心10min，弃上清液。⑥质粒DNA用70％乙醇洗涤，12000rpm，离心2min，弃上清液。⑦质粒DNA加入201al灭菌水，．20℃保存。3、检测：取质粒DNA样品10pl，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳后的凝胶置于EB溶液中染色20min，在凝胶成像仪中根据片段的大小，检测目的DNA片段是否插入质粒DNA中，从而确定出菌落为阴性与阳性克隆。1．2．8测序质粒DNA的制备、PCR反应及序列测定1、取阳性克隆菌在5mlLB／Amp培养液中，37℃振荡培养一夜。2、用V-Gene质粒DNA小量快速制备试剂盒(天泰公司)提取质粒DNA。提取按试剂盒说明。3、在核酸蛋白分析仪(BECKMAN，4、测序PCR反应反应体系20“l：DNAPrimer(M．47)MIX反应程序：DU一800)上定量所提取质粒DNA。10p,l2p,l8“l StagelStage296℃50℃60℃30cycles3min20S20S4min5、乙醇沉淀DNA①配置停止液(51x1)：3MNaOAc2pl；100mMNa2-EDTA(pH8．0)2“l；20m#mlglycogenlpl。②将PCR反应液转移到装有停止液的微离心管中，混匀，放置冰上。③加入60“1．20℃冷冻的100％乙醇，混匀，立即于13000rpm，4℃，离心15min，弃上清液。④加入200斗1．20℃冷冻的70％乙醇，立即于13000rpm，4℃，离心5rain。洗涤两次。⑤沉淀自然干燥。⑥用25“l的SLSbuffer悬浮，上样，测序。使用QIAprepMiniprepKit(QIAGEN)提取阳性克隆质粒DNA，采用CEQDTCSQuickStartKit(BeckmanCoulter)试剂盒$1CEQ8000(BeckmanCoulter)i贝lJ序仪进行测序，具体测序方法参照试剂盒说明。1．2．9序列分析及eDNA克隆根据回收片段测序结果，通过RGP(RiceGenomeResearchProgramhttp：／／rgp．dna．affrc．go．jp／E／toppage．html)进行BLAST分析获得全长cDNA序列，利用DNASTAR设计引物：5’．CTCCTCCGCCCGCGAGCTCCTCTTC．3’和．5’．GAAAGCGAACAGCAGCAGTCAGATAG．37。使用LAPolymerase(TaKaRa)进行扩增，反应条件为：94℃下预变性2min，98℃下变性15S，58℃下退火30S，72℃下延t02min，共30个循环，最后72℃下延伸5min，4℃，OO。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，然后与pUCl8Vector(TaKaRa)连接，转化后挑选阳性克隆，提取质粒DNA并测序。1．2．10RT．PCR应用Primerprimier5．0设计引物，进行RT-RCR检测。参照TOYOBO公司试剂盒提供的方法，利用Oligo(dT)ls对总RNA样品进行逆转录反应。RT-PCR扩增时，选用水稻13-actin基因作为总RNA模板定量的内标，引物由上海博亚生物技术有限公司16 合成。fl-actin基因的引物为：5’．GAACTGGTATGGTCAAGGCTG．3’5’．ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3’：OsHsp82特异引物为：5’一GACCATGGAGATCAACCCGGAGAATG．3’5’．GAAAGCGAACAGCAGCAGTCAGATAG．3l、cDNA第一链的合成①取1pl总RNA(1lxg／p1)，加入l“lOlige(dT)18(50pm01)混匀，置于65℃烘箱内5min：②配制混合液15pl，置于冰上；5×RTBuffer4plDEPC—water10．5“lRNaseInhibitor(20U)0．5山Total15“l③从烘箱内取出反应物，置于冰上，加入配制好的混合物15pl，加2“l(1NTPs(10mM)和lplReverTraAce(100U)：④在PCR仪中进行如下反应：42℃1h95℃5minOcDNA第一链合成产物在。20℃下保存。2、PCR反应反应体系：cDNA0．8pl10×ReactionBuffer2ttlMgCl2(25Mm)1．2pldNTPsMixture3．2lxlDEPC-water11．2肛l上游引物0．4pl下游引物0．4plLongTaqDNAPolymerase0．8HlTotal20p．1反应循环：StagelStage295℃94℃61．2℃72℃175min30s40S1min Stage330cycles72℃4℃10min∞3、电泳检测所得扩增产物加样在1．5％琼脂糖凝胶上作电泳分离，使用QuantityOnel-DAnalysisSoftware(BIO-RAD)对成像结果进行分析。18 2．结果与分析2．1cDNA克隆与序列分析FDD回收片段得到约500bp的片段，经测序长度为528bp，与预期长度吻合，回收片段位于cDNA全长的3’端(图5)。将该序列在RGP日本晴基因组数据库中比对，发现该片段位于水稻第9染色体。通过GenBank数据库Blastx分析，推测该基因编码699个氨基酸残基，预测分子量为80．2kD，根据数据库信息将该基因命名为OsHsp82。通过EXPASY进行MOTIF分析发现该基因编码的氨基酸26—35具有热激蛋白90家族标记；28．182具有ATPase活性区域；C端也具有MEEVD的Hsp蛋白特殊末端(图5)。2．2OsHsp82氨基酸序列相似性分析使用DNAMAN软件对水稻Hsp82、水稻Hsp90、大麦Hsp90、拟南芥Hsp90-2、玉米Hsp82、果蝇Hsp82蛋白、和酵母Hsp82蛋白进行氨基酸相识性比对。结果表明，水稻Hsp82与参与比对的热激蛋白同源性均高于64％，其中与酵母HHsp82相似性达64．1％，与果蝇Hsp82氨基酸相似性达66．3％，与玉米Hsp82、拟南芥Hsp90-2、大麦Hsp90和水稻Hsp90氨基酸的相似性分别达84．9％、90．7％、94．7％和99．7％(图8)，同样通过进化树分析显示水稻Hsp82与水稻Hsp90亲缘关系最近，而与酵母Hsp82亲缘关系最远(图4)。100％95％90％85％80％75％70％65％rice．_hsp82rice_hsl090zea．_mays_hsl082fruit_fly_hsl032yeasthsc82yeast_hsp82图4Hsp82蛋白亲缘关系分析Fig．4TherelationshipanalysisofHsp9019 '譬土拿2土2盆E窑2窖E譬E量E宝土2盆土￡S熹拿P。‘c。‘‘c‘·‘-●-tc·‘‘-‘。·c‘o--E‘oto‘o‘‘oo·‘t‘‘o-to■^S31369144115131585165717291∞11873194520172089216122332305‘E·E·ooE·‘·o‘ttc‘oottco·-‘oo‘·_·tc··cc·一ct-ct‘toocto-．te·tc·∞-oetto!!!!!．ETETF^F口AEINQL8LINTFYslcjjcjj‘‘-曩atottcotoo‘o‘●‘cto●t口tcc●●ctcotcc‘-t●oatt‘■jtja■atta●■ttc‘jea‘融。。兰。。量，。』工。生。。旦。。毛Jb!§蝉§§26．}：．．Q廷18．．E．．E．．§ooto●cC‘●c暑a‘o‘c●a‘ctc‘jt‘c‘c●‘cc‘■●‘ct‘ttc-tcc●c●tt孽tcccc‘●c●-‘‘ot-‘cj-kI殳呸§蜒k殳盎窒呈乓kE!终iy宝殳蜒皇蔓燃c-ccct●te‘-tc●tc曩-ca■t●‘t‘tc‘‘o-tE暑cc●●‘tc‘一●cctc‘tc--c●●cctc‘■t●cc-tc‘e!k璺IiQ蔓殳Y璺缝!蜒§殳k望燃隧k殳II．盎o●‘EtcC‘‘c●ccaagEa‘ttc-t‘●j‘Ic‘ctc‘et●ct‘‘t‘ot‘●t‘t‘七oo●t‘●tt‘‘‘c-‘ttt‘‘尽量殳I呸量E缝互皇k皇殳墨殳!§缝!璺呈E璺t●tc‘‘‘ttot●otoc‘oot∞ott‘tt‘ct‘●‘●‘c‘tt‘ttot●●cc●ce●●‘c●c●●o■-c毫ac‘j‘o●Y殳E][§叁)[kY盎妄足YyI蜒奠楚殳呈受‘t-tgtgtggg-Etc●c-ggccgEtEEEtocttc●ot●tt●c∞‘t‘●t-cotc．t‘‘t‘-‘c-‘ctt‘‘●c毒)[Y堂量§受皇殳璺§EIYI尽殳I§垡要霓k受贯‘‘C．t●ct●a暑●tc●ccctct-cctc●●Eg-tg-tc-Ectgg--t●octtg●g喜jEcgtcEooto●●gE●totQ工签Ik)[k蜓殳殳QLEYLERLKDL‘gtEaaEa●Eo-．tto．tEaEttcatojEctacccta_tctccot●tCE●etEaCa暑Eac暑act暑jE毒jEg●暑-tVKHSEFlSYPISLWTEKTEKEIttotE-t摹●tE--‘●c霉aEEa-g●摹●-摹--E‘●tEotE●EEaEEE●●●‘gtt‘●‘‘●t‘ttE-tEacEa‘a●SDEDEK0^EGKVEDVDEK●(a抽lra(aaa‘●‘-●‘●●--●‘--●●●‘●tc●-‘‘●●‘totcto●o■●■t‘‘-■c●t‘●t‘●●o●●‘o●‘-■EKEKIKEVSHEWNVMNKQK●ooo●_ttt‘‘ttt-‘‘●●‘cc-‘●■‘●■-tc-cc●●‘‘-●‘●■t-c■ct‘ctttct-c●●■-‘ctt●-o●●-PIWLRKPElTKEy^FYK8LTNo‘●ot‘‘‘●‘‘●●o●tot‘‘ot‘to●●‘o●ottotet‘t‘‘●■‘‘to●‘ott一●jtto●●‘‘cc●too．t‘ttDWEHLAVKHFSVEGQLEFKAILFt●t-cc●-●●●薯-●c●ce-ttt‘●cctcttt■●o●cc●●暑●●‘--■c-●-●c●●c-tc-●■ct■t●c‘t●c‘VPKRAPFDLFDTRKQNIKLYVRccE‘‘．t‘ttt●tc●t‘t-c●●ct‘t‘●‘●●‘tt‘●tcco●‘●‘t‘‘c．tc●●ctt七‘tc●-‘‘‘c-tt●tt‘-RVFIMDNCELIPEWLSFVK0IVDttot摹●-E●cottoocoto●●c-toto●oEt‘●‘●tEotoo●‘o●E●●c●-‘-too七‘●●暑Et‘-too‘c●-8EDLPLNISREMLQNKILKVIRK暑●●cctt‘tE-●暑--0t‘cEtE‘●‘ctottottt‘●薯●tc‘ot‘●E●●口--cE●●E-ct-c-●c●●Ettct-NLVKCVELFEl^ENKEDYNKFYcE暑EEotttotcc暑aEjatctc暑oEcttE暑ejtco●tEaEEjttcc∞cjaca‘EoocaaEattCct暑a暑otE^FSKNLKL0IHEDSTNRTKI^ELcctgaEgtatcactccaccaaEagtggtgatEagttgacoagcotcaaEgactacgtaacocEgatEaaggaLRYHSTKSGDELTSLKDYVT只MKE459EgEcoagagtgagatotattaoat∞otggtgagagoaagaaEgotEttgagaaotoooocttootogagaaGQSEIYITGESK^VENSPFLEK483gctg-●E●●E●●Eggtt-tE●ggtcct‘t●c●tEstt‘-tEcc●tt暑jtgjgtjcgctEttggtcaEctt●●LKGYEVLYMVD^IDEY^VGqLK507gca‘ttt‘jj‘‘cja‘aaEctc‘tctct暑ccaccaa暑EaaggtctEaaEcttg羞tgaEagtgaggac搴aga●EFE0KLV8ATKEGLKL0ESEDEK531‘aagcggcaggaggaactcaaggagaagttcEagg售tctgtgcaaEEtgatcaagEaggtgctcEEtgacj-KR0ELKEKFE0LCKVIKEVLGDK555EgtEgagaaggttEttgtctctEaccg．tgtgEtgg-ctctccctEctgtct·‘tc·ctggg‘·‘t·t量笪s垄基VEKVSDRV0SPCLVTGEYGW579量星呈圭星呈圭星量呈星圭量量星星室曼星星圭呈窒圭苎量室星星呈呈呈室量星呈圭呈圭星耋量星星量呈耋呈呈量曼呈量耋量星呈呈量量呈耋量呈星耋星圭呈耋星基T^NMERIMK^Q^LRDSMAGYMS603呈量量量i星基2星呈曼耋量基量92耋坌§童墼呈g墨萋基量妻耋星呈g室喜呈量圭gg星呈量星量呈耋呈呈量呈室星量呈g熹量呈呈量i圭量呈量g坌呈莹量KTMEINPENAlMDELRKR^DADK627量妻星耋量量呈星妻量耋呈呈苣耋量星鱼曼量耋呈呈圭量量耋量皇姜曼呈耋苣呈熹呈耋耋呈量皇量耋呈圭量呈呈呈耋曼呈熹量曼呈呈耋呈呈苣苣耋耋耋呈耋量呈耋耋NDKSVKDLVMLFETALTSGFSL量量量量量室呈呈呈坌量妻坌皇2金：耋呈苣量呈量坌窑坌苣蓦曼：呈呈耋呈呈量呈量熹量呈熹窒星星量呈耋呈量量呈呈熹量量量呈曼耋呈量量呈量量量量量呈量星EDPNTFGTRIHRMLKLGLSDEDE呈耋妻室星呈量熹量星毒量量童盆呈呈耋熹E量曼耋量￡呈曼耋耋呈耋量耋窑宝2土土2土暑E耋耋鱼耋￡22土2土22土暑E土土2土2耋耋呈耋呈星耋星量2^j逮耋2耋基妻塞苎苣窑耋基窒熹鸯耋：童E2耋熹土星!耋耋耋三量量：2宝苣耋耋量量星耋量呈星耋呈星量耋耋耋耋苣耋呈耋耋耋量耋呈耋：坌量2耋2土土量壹壹譬鲁毒土E￡E土EE土壹盆盆主土E图5OsHsp82核苜酸及氦基酸序列Fig．5ThenucleotideanddeducedaminoacidofOsHsp82FDD|口I收测序部分为双下划线，全长cDNA扩增引物为粗黑下划线部分，半定量RT-PCR引物为灰色背景部分，方框部分为Hsp90家族标记，波浪线部分为ATP结合水解区域和C端MEEVD区域为与胞质Hsp特征序列。20钉i；|e∞m例啪耋=狮柳捌粥詈堇狮啪川徭Ⅺ艏"∞甜∞刀怕创g}∞卵∞引∞为g；，234567890，2 2．3OsHsp82删_境处理下的表达分析通过半定量RTPCR方法对水稻3时期幼苗OsHsp82ZE热激和冷激两种非生物胁迫下表达分析结果表明：OsHsp82J匀显著受到热激和冷激诱导(图6、7)。在热激条件F，与对照相比OsHsp82在叶鞘中的表达明显受热激诱导。在热激后的15min表达量迅速升高，是对照的4倍多，此后逐渐下降，在1h达到最低，但也高于对照，然后逐渐升高并趋于稳定(图6A)。在根rfl的表达也能迅速被诱导，15min表达量为对照的2倍，此后变化不明显趋于稳定(图6B)。在冷激条件下．与表达量相对稳定的p-aam对照相比0s脚础莅叶鞘和根中的表达均有增加的趋势，在叶鞘中15min的表达量略高于对照，12h的表达量是对照的28倍(图7A)；在根受诱导略为迟缓些，但在12h的表达量也约为对照的2倍(图7B)。僳15m30mlh2h4h8h12hI’}1_：一g：=jr：：曩圈6OsHsp82在热激条件F的表达Fig6TheexpressionofosHxn82underheatshOCkcondition^*42℃m脚阳托¨鞘中∞女达B为42℃卢删Ⅲ在⋯靴中的表达，c为42℃仉乩P甜托根中的表t：D为42"C口删m在根中的表达。CK15m30m1h2h4h8h12h(‘——■■■■■■—■■■■■■■■■●_I)_i___·_—●I——■——●——●——一幽7OsHsp#2在冷搬皋件F的表选Fi97TheexpressionofOsHsp82undercoldshockconditionA为8℃吲却82在叶鞘中的表达；B为8‘c卢口m在叶鞘中的表达；c为8℃西地蚶2在根中的表达；D为8"Cff-acund根中的表达．21 萤¨一叠霎霸霎；雕}鞋誉Ili|蠡萋撵疆瓣殿霪群凰蠹隧瓣誊罐懿黜话羲i蚕：莪叠誊}；|；|≥≤lll11]llIH：l|,|墓ll|illllIlll!flll；l雾曼≥。||ifJ!l|]|lilliltl善鬈liI|111Iititlll囊圈-一l蠹：l}tI!111111IB!'Ii!11}薰卜i]111iillililii銎lil,i!i墓《誊霭 3．小结热激蛋白命名的由来就是其能被热激所诱导，非组成性表达的热激蛋白在正常生理条件下表达较弱，但能被热激强力诱导【104】。在本实验中也观察到在42"C处理的叶鞘d?OsHsp82的表达能被迅速诱导并保持较高的水平，15min且P能达到对照4倍的表达量，而在根中同样也能增强表达(图4)。当植物受到持续低温刺激时，Krishna等发现到甘蓝型油菜在低温(5℃)处理的第一天就能检NNHs090mRNA的增强表达，且在低温处理过程中一直保持较高水平‘1051。在本实验中也观察到在冷激处理条件下，虽然OsHsp82应答不如热激迅速，这可能也受植物在低温下整体表达水平下调影响，但Hsp82总体上表达稳步增强，其中12h表达量是对照的2倍多(图5)。此外，AtHsp90-2、AtHsp90．3能被IAA、NaCI矛I重金属离子诱导【1061。这些逆境条件都会导致蛋白质的变性，而Hsp的诱导可能和维持蛋白质构象，或是帮助变性蛋白质重新折叠、保持蛋白质活性有关。 第三章水稻Hsp82结合蛋白研究1材料与方法1．1实验材料、菌株和试剂采用日本晴，干旱、低温逆境cDNA文库；本实验室已构建好的Y2H文库；大肠杆菌菌株JMl09，酵母菌株AHl09，Y187。酵母表达载体pGBKT7、pGADT7．Rec、酵母双杂交系统所需药品购自CLONTECH：限制性内切酶、LA酶、PMDl8．T等购自宝生物公司；实验所用引物由英骏公司合成。YPDA培养基lLDifcopeptone20gYeastextract5gAgarpower20gD-Glucose20g0．2％adeninehemisulfatel5mlPH6．5SD培养基YeastnitrogenbasewithoutaminoacidsAgarpower眦lucoseDOSupplement按各缺陷培养基需求加PH0．9％NaClSolution(1OOml)0．9gNaCI-4-100mlH20以上试剂均需121℃，15min灭菌。lL6．7g20g20g5．81．1×TE／LiAcSolution(10m1)1．1ml10XTE+1．1ml1MLiAc(10x)+无菌水至10mlPEG／LiAcSolution(10m1)8ml50％PEG3350+1ml10×TEbuffer+1mllMLiAc(10×) XI-Q—Gal(20mg／mlinDMF)；Kanamycin(50mg／m1)；HerringTestesCarderDNA(10mg／ml，denatured)1．2实验方法1．2．1pGBKT7．OsHsp82载体构建OsHsp82iJI物OsHsp路U5’一CGCGCATATGGCGTCGGAGACCGAGACGTT一3’NdeIOsHsp路L5’一TCCACTGCAGTTAGTCGACCRCCRCCATCT一3’PsflPCR反应体系：cDNA5“l10×ReactionBuffer51xldNTPsMixtur(2．5mM)41．tlMgCI(25mM)3“lOsHsp82一U0．5“lOsHsp82-L0．5肛lLATaq0．51xlddH2031．5LLl-———1I——。。●_●-●--__l●-_l______________I-●●。■一Total50／al反应程序：StagelStage295℃94℃61．2℃72℃5min30S40s2min×25cyclesStage372℃10min4℃CO反应结束后取51xl于l％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物。OsHsp82片段回收 1．将PCR反应液在1．5％琼脂糖凝胶上电泳30min。2．在紫外灯下小心切割下目的DNA条带。3．将切下条带装入1．5ml离心管中称量。4．加入3倍体积的溶胶液(凝胶重O．19视为1009l，以此类推)，50"C水浴10min，期间不断温和上下翻转离心管，确保胶块充分溶解。5．待溶胶液温度下降到室温时将溶胶液加入一个吸附柱CB中，12000rpm离,t二,30s，倒掉收集管中废液。6．)JHN700I，tl漂洗液，12000rpm离，5,30s。7．)JHN500J．tl漂洗液，12000rpm离一1二,30s。8．耿出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间加入301xl洗脱缓冲液，室温放置2min，13000rpm离心1min。9．用核酸蛋白分析仪(BECKMAN，DU．800)测回收DNA含量。OsHsp82连接至UpMDl8．T、转化、检测及测序同第二章1．2．5，1．2．6，1．2．7，1．2．8OsHhsp82，pBGKT7质粒双酶切10×HBU腩rNdeIn，IDNAddH20OsHsp82连接到pBGKT7O．03pM酶切质粒片段加上0．3pM酶切目的片段加入等体积SolutionI(TakaraDNALigationKitVer2．O)，16。C连接1h。1．2．2酵母感受态细胞的制备1．在YPDA培养基上划线培养Y187或AHl09菌株，30℃，约3天；2．接种一个单克隆(直径2-3mm)到3mlYPDA培养液中，30。C，8h；3．取5“l移液到装有50mlYPDA的三角瓶中，30"C，250rpm，16．20h，至OD600=O．15-0．3：4．室温离心7009，5min后，弃上清，用100mlYPDA悬浮沉淀，30℃，3—5h，至OD600=0．4—0．5；5．室温离心7009，5min，弃上清，60ml无菌水悬浮；叫MⅥ№叫)2缸O巾舯 6．室温离心7009，5min，弃上清，3m11．1×TE／LiAcSolution悬浮；7．分开悬浮液到两个1．5ml离心管，高速离心15秒，弃上清，分别用600ul1．1xTE／LiAcSolution悬浮。1．2．3转化到酵母菌株AHl09或Y1871．将5ulCarrierDNA(事先沸水煮5min后立刻插到冰上变性)，250ng质粒DNA，50ul酵母感受态细胞混在一起；2．加500“lPEG／LiAcSolution，温和的混匀充分，30。C，30min，每10min混匀一次；3．加20lxlDMSO，42℃水浴，每15min混匀一次；4．高速离心15S，去上清，1mlYPDAplusLiquidMedium悬浮，30。C，90mira5．高速离，tb15S，去上清，1mlNaClSolution悬浮，温和地上下颠倒混匀。6．按200gl／150．mmplate涂到以下3种缺陷培养基上。●SD／-1邗／灌Q_Gal·SD／-His／却／X-a-Gal·SD／_Ade／却／X-Q_Gal1．2．4检测I)NA—BD融合基因的自身转录活性1．分析自身转录活性。一·以下情况出现表明诱饵蛋白没有自身转录活性的。SD／_1却／X—Q-Gal长出菌落，且为白色；SD／-His／一m／X_Q-Gal和SD／_Ade／珈／X_Q_Gal无菌落长出。◆以下情况出现表明诱饵蛋白有自身转录活性。SD／—唧／X-Q-Gal长出菌落，但呈蓝色；SD／_His／珈／X．Q_Gal和SD／_Ade／却／X_Q-Gal长出菌落。2．假如发现SD／_His／_1砷／X_Q七al上存在背景，则双杂交时需在四缺培养基中加入3一AT。3．假如发现SD／-His／却／X_Q—Gal和SD／一Ade／却／X-Q_Gal都存在背景，则表明此诱饵蛋白很难用于双杂交。1．2．5检测诱饵蛋白对酵母的毒性1．将空载体pGBKT7转入酵母感受态细胞中，做对照；2．挑单克隆(2．3mm)到50mlSD／_1砷／Kan(20．g／m1)，30。C，250rpm，过夜培养；27 3．检测OD600应>t0．8，假如OD600远小于O．8，则表明诱饵蛋白可能有毒性。1．2．6酵母共转化1．15ml离心管中加入下列试剂，混匀；20“ldsCdna6rtlpGADT7-Rec(0．5pg／p1)5lagpGBKT7一Hsp90(-ATPase)plasmidDNA(≤10lal)20“lCarrierDNA(denatured)2．加入600“l感受态酵母细胞AHl09，轻轻混匀；3．加入2．5mlPEG／LiAcSolution，轻轻混匀，30℃，45min，每15min混匀一次；加入160lxlDMSO，混匀，42℃水浴，20min，每10min混匀一次；离心700g，5min，去上清，3mlYPDAplusLiquidMedium悬浮，30℃，振荡培养90min；离心700g，5min，去上清，用6mlNaCISolution(O．9％)悬浮；按200pl／150．mmplate涂在TDO或QDO培养基上，30℃：●TDO：：SD／—His／_Leu／_1砷·QDO-SD／-Ade／_His／-Leu／_1唧2天后慢慢出现白色菌落，约5天后将直径>2mill的转移到新鲜的SD／-Ade／—His／-Leu／o砷／X_Q—Gal上划线培养，进一步筛选；30℃，2_4天，变蓝的为阳性菌落；菌落PCR，回收目的条带，连接到pMDl8．T上，测序(方法见第二章)，NCBI网上比对序列，确定目的蛋白。1．2．7pGEX．OsHsp82载体的构建OsHsp82的扩增：pGEX-82-U：5’gcgc匹￡g盆￡atggc舒cggagaccgagac3’SalIpGEX一82-L：5’ggtcg￡gg￡坌g坌tta寸cgacctcctccat3’NotIPCR反应体系：cDNA1O×ReactionBuffer51xl28乱殳丘L&钆仉 dNTPsMixtur(2．5raM)41alMgCI(25mM)31．dpGEX一82-U0．51．dpGEX一82一L0．51xlLATaqO．51alddH203-1．5LLl。．L-Io—Total50Itl反应程序：StagelStage2Stage395℃94℃60℃72℃×25cycles72℃4℃5min30S40S2min10min∞目的片段回收、连接至IJpMDl8T、转化进JMl09、检测及测序同第三章1．2．3，第二章1．2．5，1．2．6，1．2．7，1．2．8OsHsp82、pGEX双酶切：lOxHBuffer21al0．I％BSA21alNotI1lxlSalIllxlDNAuptolp,gddHzOupt0201xlOsHsp82和pGEX回收、连接同第三章1．2．1OsHsp82片段回收，OsHsp82连接到pBGKT7；转化同第二章1．2．6，但大肠杆菌菌株改为BL21；检测同第二章1．2．7。1．2．8pET-RBBl3．3载体的构建RBBl3．3扩增引物RBBl3·3-U．-5’taca幽atgagcaacactaccatggc3’SacI29 RBBl3-3-L：5’ctgtg￡gg￡￡g￡agttctccgctcggggtt3’NotIPCR反应体系：cDNA51xl10×ReactionBuffer51xldNTPsMixtur(2．5mM)4p．1MgCI(25mM)3“lPrimer-U0．51alPrimer-LO．5“lLATaqO．51．tl亟亟HzQ三!：§丛lTotal501xlPCR反应程序：StagelStage2Stage395℃94℃61．2℃72℃×25cycles72℃4℃5min30S40S2min10min∞反应结束后取51xl于1％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物。RBBl3—3回收、连接至lJpMDl8T、转化进JMl09、检测及测序同第三章1．2．3、第二章1．2．5，1．2．6，1．2．7，1．2．8。RBBl3—3、pET-30a双酶切：lOxKBuffer1“l0．I％BSA21alSacIlp．1NotIl“lDNAupt01P,gddH20．upt020plRBBl3．3、pET回收、连接同第三章1．2．1片段回收，连接；转化同第二章1．2．6，但大肠杆菌菌株改为BL21；检测同第二章1．2．7。30 1．2．9蛋白质体外诱导表达及检测1．挑取单个菌落用lml适当培养液(pGEX用LB+amp，pET-30a用LB+kana)1．5ml离心管在37。C培养过夜。2．第二日上午将lml分装于2个5ml适当培养液L管，37℃水浴培养至OD600=0．6．3．在其中1管中加入100mmol／LIPTG50I，tl，并于管壁注明，37℃水浴培养3h。4．取201xl培养液加入5“lSDS．PAGE上样缓冲液，于100℃沸水中煮沸5min。5．以ProteinMolecularWeightMarker做marker，将25Itl样品点入12．5％SDS．PAG电泳。6．考马斯亮南染色30min，脱色1h，观察结果。1．2．10检测诱导蛋白可溶性1．取7501xl已诱导培养液，100009离一61lmin。2．去上清，加入750“lddH20，彻底悬浮，100009离心lmin。3．去上清，加入745“lddH20，彻底悬浮，加入51a110mg／ml溶菌酶，冰上静置10min。4．运用JY88．II超声波细胞破碎机，采用50％强度，50％密度，破碎2min。5．161009离一615min。6．取20I．tl上清液加入51alSDS．PAGE上样缓冲液，于100*C沸水中煮沸5min。7．用未破碎诱导培养液做对照，将25Irtl样品点入12．5％SDS．PAGE电泳。考马斯亮南染色30min，脱色1h，观察结果。1．2．11GST标签蛋白纯化洗脱缓冲液的配制：0．5mM谷胱甘肽100}tlO．5mMTris缓冲液100p1ddH208001xl保存于．20℃细胞裂解：1．取lmll．2．8已诱导菌液，100009离，611min。2．去上清，将沉淀．20℃冷冻20min。3．加入200¨lMa911eGSl删细胞裂解液，轻轻混匀。4．}JH／N．21xlRQ1RNase-FreeDNA酶。5．室温下摇床震荡30min。3l 磁珠准备：1．充分混匀MagneGSTTM磁珠，吸取20pl磁珠。2．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。3．加入250“lMagneGST俐Binding腑协h缓冲液，4．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。5．再重复3、4步骤2次。6．力11／k．1001．tlMagneGST刑Binding愚协h缓冲液，GST标签结合和清洗：轻轻用枪打混匀。充分悬浮。1．将2009l裂解液力W,N．100p,1已清洗的磁珠中。2．室温下摇床振荡30min。3．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清，保存上清用SDS—PAGE检测。4．加入250肛lMagneGST聊Bindin∥W瓠h缓冲液，轻轻用枪打混匀，在室温下放置5min，期间颠倒离心管数次以确保磁珠未沉淀。5．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。6．JJI：I)X．250I．tlMagneGSTⅢBinding／Wash缓冲液，轻轻用枪打混匀。7．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。8．再重复6、7步骤一次。GST蛋白的洗脱：1．加入200“1洗脱液到已完成清洗的磁珠中。2．室温下轻轻振荡15min。3．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清，保存，用SDS．PAGE检测结果。1．2．12蛋白质体外结合1．取lO“l已吸附Hsp82和仅吸附GST的磁珠，加入200RBBl3．3或PRPl细胞破碎上清液，在空气摇床室温下孵育1h。2．将离心管至于磁铁旁，小心吸出上清。3．力ll,N．4001．dMagneGSTmBindin∥Wash缓冲液，轻轻用枪打混匀，在室温下放置5min，期间颠倒离心管数次以确保磁珠未沉淀。4．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。5．加入400“lMagneGSTⅢBindin∥WaSh缓冲液，轻轻用枪打混匀。6．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清。7．重复冲洗4次。8．力N)k200lxl洗脱缓冲液，置于空气摇床室温下震荡15min。9．置离心管于磁铁旁，小心吸出上清，保存，用SDS．PAGE检测结果。32 2．结果与分析2．1酵母双杂交结果与分析通过酵母双杂交的方法最终在4缺培养基上筛选出了11个菌落，通过PCR扩增从筛选出的菌落中共得到13个片段，同一酵母菌落得到多个片段的加．1、．2以示区别(图9、10)。通过将得到的13个片段测序后与NCBI中核苷酸序列比对，发现13个片段分别属于7个全长eDNA(表1)：(1)．片段2．2、3、8．2测序结果与GenBank中NM_001065421的cDNA中268bp的序列相似性高达98％。该基因编码一个含137氨基酸残基的蛋白质，cDNA编码区为414bp，是参与光合系统II的分子量为10kD的蛋白，能与光合系统II放氧复合体结合，但其在光合系统中的具体功能尚不知晓。(2)．片段4、6、7、8．1、9测序结果与GenBankqbAY224438的eDNAdP248bp的序列相似性高达98％。该基因编码一个富含脯氨酸由416个氨基酸残基组成的蛋白质，cNDA编码区为125lbp。该蛋白是被作为SGTl的结合蛋白而报道的。(3)．片段5测序结果与GenBank中AJ277469的cDNA中528bp的序列相似性高达98％。该基因编码水稻RBBl3．3蛋白，含254个氨基酸残基，具有胰蛋白酶抑制剂作用。(4)．片段10钡,q序结果与GenBank@NM_001062457的eDNA序列中231bp序列有93％的相似性。该基因编码水稻细胞色素P450，由512个氨基酸组成，eDNA长度为1539bp。‘(5)．片段2—1测序结果与GenBank@NM_001066803的eDNA序列中443bp相似性高达99％。该基因编码一个含244氨基酸的蛋白，eDNA的编码区为735bp，与2．1片段长度吻合。该蛋白的功能尚不清楚，但其氨基酸序列中包含一个ti匆和一个CCT2功能域，功能域在许多含和其他区域植物转录因子中都有发现，而2．tifyGATACCT功能域是CCT功能域的一个分支构象，与CCT的N端构象较为相似，而CCT构象有个推测细胞核定位的信号肽。(6)．片段1测序结果与GenBank中NM001049892的eDNA序列中326bp序列有96％的相似性。该基因编码蛋白功能未知，含有一个DUF866家族的功能未知功能域。(7)．片段11测序结果与GenBank@NM_001053567的cDNA序列中294bp相似性高达95％，该基因编码蛋白功能未知，也不含已知功能域。33 表1．阳性克隆测序结果及分析Table1Theanalysisandsequenceofpositiveclone阳性克隆片段长度比对结果基因库中同功能编号源水稻基因4900bpLength=1251bpProline—Rich参与细胞壁次67900bp650bpIdentity=214／248(86％)ProteincDNA级结构和发育Identity=275／319(86％)Identity=535／551(97％)8．1900bpIdentity=309／328(94％)9900bpIdemity=521／525(99％)2-2650bpLength=414bpPSII10kD和光合系统II38．21000bp650bpIdentity=265／268(98％)，polypeptide，放氧复合体结Identity=114／123(92％)chloroplast合，功能朱知Identity=354／377(93％)precursorcDNA51000bpLength=765bpRBBl3—3cDNA抑制胰蛋白和胰Identity=522／528(98％)凝乳蛋白活性，参与对真菌的抗性10900bpLength=1539bpCytochromeP450氧化降解多种Idemity=216／231(93％)98A化合物2．1800bpLength=735bpUnkownProtein"含寿'tify、CTT_2Identity=441／443(99％)cDNA区域和核定位信号肽400bpLength=735bpUnkownProtein含有功能未知Identity=316／326(96呦eDNA的DUF866区域1650bpLength=296bpUnkownProtein未含有已知功Identity=280／294(95％)cDNA能域34 r_糕厂1—1。～，·-；r．jij叶～’|-·两"’一‘寸，nHr-融、、、。。哆-l’．o。●-图9酵母双杂交阳性克隆菌落Fi99ThepositiveclonesfromY2H^方培养m巾为荫落1{。右方蚺并埘【小u标出9-1I固10酵母阳性克隆回收，÷段Fig．10ThecDNAsequenceofposotiveclones 2．2体外结合实验结果将pGEXOsHap82和pET—RBBl3—3质粒转化进DL21大肠杆苗，成功在体外诱导出了目的蛋白，GST为28kD(图liB)、GST-lisp82为100kD([]lid)、RBBl3—3为30kD(图12c)，并通过GST纯化系统得到GST、GST-Hsp82(图3c、F)。通过GST-Pul]down系统用纯化的GST—Hsp82和GST对照与RBBl3—3诱导上清液傲体外结合，未能榆测到RBBl3—3和Hsp82的结台。kDaMABfDEF116．066．245．035．025．O、～．≯}图11OST、GST-OsHsp92诱导及纯化SDS'PAGE电泳图Fig．11TheinduceAaⅡdpurifiedproteinofGSTandGST-OsHsp82M为眦k⋯AD为GST、GST-Ilsp82未诱导。B、E为GST、GST-Hs呻2加ImMIPTG诱导-c、F为GSTGSToHs．呻2纯化。-kOflhI^BfD116066245035025O184144、幽12RBBl33诱导幽Fig．12TheRBBl33inducedbyIPTGM为肿ker，B、D为p盯、RBBl33朱诱导，^、c为pelf、RBBl3—3加^IeT6I删诱导36 3．，J、结通过酵母双杂交的方法研究Hsp90家族中OsHsp82的结合蛋白，筛选出7个OsHsp82结合蛋白，分别是：水稻PRPl蛋白、水稻RBBl3．3蛋白、水稻光和系统II10kD多肽、水稻CYP98蛋白和三个未知功能蛋白。该7个蛋白均是首次作为OsHsp82结合蛋白被发现。通过Myhits(http：／／myhits．isb-sib．ch／cgi-bin／index)分析功能域，发现这7个蛋白并不具有相同的功能域，推测它们可能通过和OsHsp82结合行使了不同的功能，或者是OsHsp82在它们功能行使的过程中扮演了不同的角色。为了进一步验证结合关系，运用GST-pulldown系统验{=iEOsHsp82和RBBl3．3的体外结合，遗憾的是并未发现它们在体外结合，可能是由于RBBl3．3需要在细胞内进一步修饰或者需要特殊的体内环境才能与Hsp82结合位点识别并结合，也可能结合发生在植物生理周期的特定阶段或是RBBl3．3在行使特定功能时。RBBl3．3与OsHsp82结合的具体的生物内环境和生理条件还需进一步研究。37 第四章讨论与展望Hsp90家族是一类在细胞内大量存在且高度保守的分子伴侣，在未诱导条件下Hsp90表达量能达到胞质可溶蛋白总量的1％l’明，它帮助折叠、保持构象，调节一系列的胞质蛋白。对于保持如甾体激素受体和激酶的关键信号因子的活性而在信号传递中扮演了重要角色㈣’1叫。本实验通过对仇脚韶氨摹酸比对发现且都具有Hsp90家族特征序列和C端MEEVDJI段，而ATP结合水解区域序列也较为保守，尤其是与果蝇和酵母热激蛋白都具有大于60％的相似性说明Hsp82对于昆虫和真菌类生存的重要性和进化的保守性。Hsp90蛋白在热激、拎激、高盐等条件F能被诱导【1悼10q。在本实验中也发现在热激(42℃)、冷激(8℃)处理下，OsHsp82能够得到诱导(图4、5)，而且热激诱导更为强烈和迅速，说明OsHsp82参与水稻热激、冷激逆境麻答或是在逆境条件下维持蛋白质构型、活性。巍1—盈【．[竺竺刍⋯。幽I3PP5结构(a】蓝色部分为TPR，绿色嚣分为辟酸化催化位点，n色部分为自动抑制E域；(b)。JHsp00结台的3个mⅡ氯基酸拽基，Hs32(绿色)、【驴"(t【紫色)、A吲0l(蓝绿色)6Hsp90很大的构象弹性和形成大量有活性的共分子伴侣给予了Hsp90多重的功能和大量的底物‘⋯‘I。能够和许多分子伴侣、共调节因子和底物蛋白结合，其中比较经典的是以蛋白质磷酸酶5(PP5)为代表的含T豫组件蛋一质依赖C端MEEVD与Hsp90结合和以p23为代表的在N端结合的蛋白。PP5含有3个34肽重复序列(TPR)组件，磷酸化催化位点和c端的自动抑制区域⋯01(图13a)，PP5和H印90的结合位点的3个重要氨基窜残基也被研究发现¨¨1(幽13b)。PP5和Hsp90通过TPR区域的结合复合体足糖皮质激38 素受体一Hsp90复合体的主要组成部分‘112l(图14)，当激素信号结合后．信号受体复合体就二聚化并结合在DNA上启动目的基因的转录。与PP5不同的是．p23能和Hsp90的N端结合，p23是个小酸性蛋白具有分子伴侣活性且高度保守，普遍存在⋯”，但它和hsp90的结合要依赖ATP结台和Hsp90的二聚化mq。Hsp90与底物蛋白的结台需要ATP的结合，也常常需要共伴侣分子p23t””，尤其对参与细胞调节成分的折叠和保持活性是很重要的，如类固醇受体、蛋白质激酶【”51、端粒酶I““。Hsp90能在ATP一和ADP-的构型问转换，而p23只与ATP．Hsp90结合并，并帮助维持该构型⋯”，此外p23能主动的与变性蛋白结合使其保持在一种预折叠状态从而更直接地参与分子伴侣作用过程⋯”，因而p23具有N眚'／Hsp90活性和结合末折叠底物的双重角色。囤14糖皮质激素受体复合体Fig14GRcomplexwImHsp90PP5通过丁PRl扑{sD帅二聚体C端结台-p23与Hsp90N端结告在动物中，Hsp90结台蛋白研究是较为流行的课题，不断有新结合蛋白报道。本文通过酵母双杂交的方法研究Hsp90家族中OsHsD82的结台蛋白，筛选出7个OsHsp82结合蛋白，分别是：水稻PRPl蛋白、水稻RBBl3．3蛋白、水稻光和系统11lOkD多肽、水稻CYP98蛋白和三个未知功能蛋自。水稻PRPl蛋白由一个富含脯氨酸的416个氨基酸残基组成．分子量为465kD，N端有疏水的信号肽，紧接着是富台脯氨酸、谷氨酸和赖氨酸并包含有多个PEPK重复的亲水片段，可能通过富含的谷氨酸和赖氨酸形成自联，它的这种特点可能与参与细胞壁次级结构形成有关{I”J。对与PRPl同源性较高的OsPRP研究发现其表达有一定的组织特异性和发育调节特点，在幼苗期和成熟植株所有组织中均有表达，但在根和胚 乳中表达量较少，而甲基化茉莉酮、脱落酸能对幼苗期的OsPRP表达起到负调控作用1120】。推测PRPl可能不仅和细胞壁次级结构形成有关还参与了植物的发育过程。迄今为止，未见有关PRPl矛1]Hsp结合的报道，本实验结果是一个新发现。而本实验通过Y2H得到五个编码PRPl的片段，这种重复性也进一步证实了PRPl蛋白与Hsp82结合的可靠性。虽然没有关于PI冲1和Hsp结合的报道，但也有PRPl结合蛋白的相关报道。Copper等【12¨运用酵母双杂交的方法发现，OsSGTl的200．368氨基酸残基的位置能分别和Pl冲1氨基酸残基134—254、182．366、207．344的区域结合，其中PRPl结合的核心部位为氨基酸残基207．254区域。而SGTl在较早就被报道能和Hsp90结合，。Takahashi等【1221的研究发现SGTl能和Hsp90结合，HvSGTlN端的21—98AA的TRP区域能和HvHsp90C端的MEEVD组件相结合，同时HvSGTl的CS(CHORD—containingproteinandSGTl)区域断1]Hsp90的N端相结合但受其他区域调节。从前人研究结果分析可能存在通过SGTl间接形成Hsp82、PRPl平I]SGTl3聚体复合物的情况，而这种3聚体的结构可能组成THsp90参与植物抗病应答或植物发育过程功能复合体的核心部位。而实际上，也有研究报道Hsp90能和TPR蛋白、非TPR蛋白形成3聚体【1231，女I]TPR类型的Hop能分j]1]$HHsp90、tETPR类型的分子伴侣cdc37结合，形成3元的分子伴侣复合物【1241，同时也有报道Hsp90、SGTl和RARl也可能形成3元复合物参与R蛋白抗病应答【1221。可能由于本实验采用干旱、低温逆境下的水稻cDNA构建文库，并未从菌落中筛选出SGTl片段，不排除存在多种结合方式的可能性。而在本实验中发现的OsHsp82与PRPl直接结合的方式可能在参与功能行使和对下游蛋白的调节等方面有所区别，而进一步实验已经展开。有报道发现水稻PRPl蛋白能和水稻shagyy—like蛋白激酶(登录号AAK38313．1)120．435AA结创1211。该激酶含有STKc功能域，具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶功能(图15)。PRPl在该蛋白激酶的结合的STKc功能域具有有ATP结合／水解活性，因而我们推测PI冲1和Hsp82的结合可能ATP结合位点有关，但本实验室的其他实验结果显示不含ATP结合位点的Hsp90家族仍能与PI冲1结合，推测也可能存在多个结合位点，但还需要进一步的实验验证。近年来有关Hsp90家族和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶酶结合的报道屡见不鲜，包括HRI、Gcn2、Perk、PKR等【1081，Hsp90扮演的是抑制剂的作用，待有适当的信号导入时解开结合状态，恢复酶活性调节下游蛋白。研究发现Hsp90能同时和PKR的两个功能域N端的双链RNA结合区域(dsRBD2)矛IC端的激酶活性区域结合，-让PKR保持在无活性的状态11251。双链RNA和Hsp90抑制剂格尔德霉素能解开40 Hs口90和PKR复台体，恢复PKR激酶活性㈣1，而dsBRD2区域本身能结合并抑制PKR激酶活性‘”61，Hsp90作为此类蛋白抑制剂的具体作用机理尚待进一步研究。同样地，．水稻Shaggy．1ike蛋白激酶s’rKc功能域c端也有具自身调节功能的片段，能通过结合酶活性区域可逆的改变构象，抑制自身酶活性。是否OsHsp82也可作；勾EShaggy-like蛋白激酶抑制剂，参与下游蛋白活性调节或是信号的传导．以及PRPI在其中的作用都有待进一步研究。·，J’(0“’}6’■■——■■—■■■j面a■——■■■■lSTKc卧5ShaggyAike蛋白傲酶功能域分析Figl5FunctionaldomainanalysisofShaggy—Iikeproteinkinase另一个OsHsp82的结合蛋白是水稻RBBl3*3蛋白，含254个氨基酸残基，N端l一44氨基酸残基构成了个疏水的区域可能是作为信引捷．紧接着是3个富含半胱氨酸的具有丝氢酸蛋白酶抑制剂活性的重复区域(图16)．能够抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶家族活性，是植物自身抵抗病原体感染机制的重要部分。RT-PCR和原位杂交的方法揭示该基因在根、叶、花、颖果中都有表达，在萌发种子肛和胚乳的上皮组织有较高表达量¨27l。RBBl3—3表达还能被损伤、茉莉酸、乙烯信号所诱导[”8I，用基因枪将RBBI基因导入水稻愈伤组织，发现过量表达RBBI基因能够增强水稻转基因植株对稻瘟病病原体的抗性[””。迄令为至，除了与抑制蛋白酶结合，未见其他RBBI结合蛋白的报道。在本实验的体外结合验证中并未检测到Hsp82和RBBl3．3的结合，据此分析可能是RBBl3—3需要在细胞内进一步修饰才能-与Hsp82结合位点识别，或者是在逆境条件下RBBl3—32作为Hsp90底物结台，受Hsp90保护维持其构象和活性，也可能是要在其他因子的存在和帮助下才能相互识别并结合。到目前为止尚未有关蛋白酶抑制剂可以作为Hsp90底物的报道，而RBBI类蛋白酶抑制剂可能会成为Hsp90家族的一类新底物．而其抑制功能可能要通过Hsp90家族介导的与蛋白酶的结合，当信号导八后解开Hsp90介导的结合，恢复蛋白酶活性。这将可能成为Hsp90家族参与信号传导和功能调节的新途径。 RBBl3—3Signalpeplide32图16RBBl3-3结构图Fi916StuctmeofRBBl3-3高温胁迫会导致植物光合效率下降，发生光合作用的光抑制f“9】。但经过热锻炼后能降低高温对光合作用，尤其是对PSII的影响‘”Ol。而PsII中最易受高温影响的是光和电子传递链中的是放氧复合体，而在高温下叶绿体sHsp能增强放氧复合体的稳定性【l”I。本实验中发现OsHsp82的结合蛋白lOkD的PsII叶绿体前体蛋白含有PsbR[噩域能够和放氧复合体结合．而C端有疏水类囊体转移信号肽，具体功能未见报道。而Hsp90家族有参与蛋白质转运的报道l”2】，分析该多肽可能是做为底物，在转录完成后折叠完成前与Hsp82结合．保持其在完全折叠的无活性状态并防止在转移到!ff的地前聚集，在确保转移到目的地后解除结合状态，恢复活性，行使其功能。而本实验中发现的Hsp82结合蛋白RBBl3—3和10kD的PsII叶绿体前体蛋白均在N端有疏水的信号肽，该信号肽是否参与结合的调节还需进一步实验研究。另外一个结合蛋白是水稻CYP98蛋白，该片段cDNA全长1539bp，编码512个氨基酸，属于细胞色素P450家族赣日胞色素I)450是一类具氧化降解多种化合物活性的蛋白，尤其对于降解一些环境毒素和诱变剂，而CYP98亚家族具有类苯基丙烷3．羟基化活性。而细胞色素P450家族中CYP2E1研究较为深入，CYP2EI是细胞色素P450家族中循环最为迅速的，它的降解是经泛素蛋白酶体途径，它是第一个被报道为Hsp90底物的细胞色素P450[ml，而本实验中发现的CYP98家族蛋白与Hsp82的结合模式和是否参与的调节尚不清楚，还需进一步的验证。通过酵母双杂交得到的另外三个蛋白功能未知，其具体功能和，Hsp90结合的模式还有待进一步研究。大量已知的Hsp90结合蛋白都有参与信号传导和细胞周期控制，但目前对于Hsp90结台蛋白了解还很片面，本文首次运用酵母双杂交技术分析了水稻Hsp82结合蛋白，并发现了7个OsHsp82结合蛋白，并对其中4个蛋白的功能和可能的结合模式做了简略的阐述，可能是由于本实验q，cDNA文库是以干旱和冷激RNA为转录模板，在本实验 中并未发现已报道的Hsp90家族结合蛋白或其在水稻中的同源蛋白，而本实验中发现的7个蛋白均未有与Hsp90家族结合的报道，是对Hsp90结合蛋白的一个补充。而通过发现更多、更全的结合蛋白对于研究Hsp82及Hsp90家族分子伴侣机理、信号传导途径以及植物逆境应答有着重要意义。43 参考文献1．曹仪植，宋占武．植物生理学．兰州大学出版社，第一版(1998)2．孟焕文，等．黄瓜幼苗对热胁迫的生理反应及耐热鉴定指标筛选．西北农业学报，2000，9(1)：96·993．RitossaF-1962．AnewpuffingpatterninducedbytemperatureshockandDNPinDrosophila．Experientia,18：571．574．TissieresA。1974．SomenewproteininducedbytemperatureshockinDrosophila．JMolBiol，84：389-3985．VierlingE，1991．Therolesofheatshockproteinsinplants．AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMotBiol，42：579-6206．LeeGJ，PokalaN，VierlingE，1995．Structureand认vitromolecularchaperoneactivityofcytosolicsmallheatshockproteinsfrompea．JBioChem，270：10432-10437．Nieto—SoteloJ，MartinezLM，PonceGCassabGAlagonA，MeeleyRB，RibautJM，YangR，2002．MaizeHSP101playsimportantrolesinbothinducedandbasalthermotoleranceandprimaryrootgrowth．ThePlantCell，14：162l16338．RisticZ，UilliamsG'YangGE，eta1．Responseofxylemrayparenchymacellsofredosierdogwood(CorpussericeaL．)tofieldfreezingstress，andtofreeze·thawcycle．J．PlantPhysiol，1996，149：424-432．9．CellierF．，ConejeroG，BreitlerJ．C．，eta1．-Molecularandphysiologicalresponsestowaterdeficitindrought-·tolerantanddrought··sensitivelinesofsunflower．Accumulationofdehydrintranscriptscorrelateswithtolerance．PlantPhysiol，1998，116：319-3210．陈忠，苏维埃，豌豆热激蛋白Hpc60研究，植物学报，1999，41：1090．10911．LeeJ．H．，HubelA．，SchofflF．DerepressionoftheactivityofgeneticallyengineeredheatshockfactorcausesconstitutivesynthesisofheatshockproteinsandincreasedthennotoleranceintransgenicArabidopsis．Plant3，1995，8：603—61212．FerulloJM，NespoulousL，TriantaphylidesC，1994．Gammaray-inducedchangesinthesynthesisoftomatoprticarpprotein．PlantCellEnviron，17：901911．13．HamiltonIIlEW,ColemanJS，2001．Heat-shockproteinsareinducedinunstressedleavesofNicotianaatenuata(Solanaceae)whendistantleavesarestressed．AmJBot，88：950—95514．BeaterJ，PotterE，KioppstechK，1992．Theelectofheatshockonmorphogenesisinbarley．Plantphysi01．，100：1780·17815．吴厚雄，肖辉海，李必湖，植物热激蛋白的研究进展，生物技术通报，2003，4：6．1316．SanchezYLindquistS，l990．HSP104requiredforinducedthermotolaerance．Science，248：l11211l17．JinnTL，ChangPEL，ChenYM，1997Tissuetype-specificheatshockresponseandinununolocalizationoftheclassllowmolecularweightheatshockproteinscomplexinsoybean．PlantPhysioll14：429--43l8．LeeGJ，PokalaN，VierlingE，1995．Structureand认vitromolecularchaperoneactivityofcytosolicsmallheatshockproteinsfrompea．JBioChem，270：10432-104319．LeeGJ，PokalaN，VierlingE，1995．Structureand认vitromolecularchaperoneactivityofcytosolicsmallheatshockproteinsfrompea．JBioChem，270：10432-1043。20．SanmiyaK，SuzukiK，EgawaYShonoM，2004．Mitochondrialsmallheat-shockproteinenhancesthermotoleranceintobaccoplants．PEBSLett，557：265-2621．JofreA，MolinasM，PlaM，2003．A10一kDaclass—CIsHspprotectsE．colifromoxidativeandhightemperaturestress．Planta,217：813—81922．JinnTL，ChenYM，LinCY,1995．CharacterizationandphysiologicalfunctionofclassIlow-molecularmass，heat-shockproteincomplexinsoybean．PlantPhysiol，108：693—70123．ParsellDA，LindquistS，1993．Thefunctionofheat-shockproteinsinstresstolerance：degradationand reactivationofdamagedproteins．AnnuRevGenet，27：437-24．Lopez．MatasMA，Nunez只SotoA，Allonal，CasadoKColladaC，GuevaraMA，AragoncilloC，GomezL，2004．Proteincryoprotectiveactivityofacytosolicsmallheatshockproteinthataccumulatesconstitutivelyinchestnutstemsandisup-regulatedbylowandhiightemperatures．PlantPhysiol，134：1708一17．25．CollinsGQNieXL，SalverME，1993．Heatshockincreaseschillingtoleranceofmungbeanhypocotylstissue．PhisiologiaPlantarum．89：ll7-l226．KadyrzhanovaDK。VlachonasiosKE，Ververidis只DilleyD心1998．Molecularcloningofanovelheatinduced／chillingtolerancerelatedcDNAintomatofruitbyuseofmRNAdifferentialdisplay．PlantMolBiol，36：885-8927．CollinsGGNieXL，SaltveitME，1995．Heatshockproteinandchillingsensitivityofmungbeanhypcotyls．JExpBot，46：795-80228．AsadaK，1994．Productionandactionofactionofactiveoxygenspeciesinphotosynthetictissues．In：FoyerCH，MuUineauxPM，(Eds)，CauseofPhotooxidativestressandAmeliorationofDefenseSystemsinPlants，CRCPress，BocaRaton，FL，771029．Miyao-TokutomiM，Byung—HyunL，MizusawaphotoinhibitionofphotosystemII．In：GarabGYamamotoN，1998．ActiveoxygenandProceedingsoftheXithInternationalCongressonPhotosynthesis，V01．II．KluwerAcademicPublishers，Dordrecht，2097--210230．LeeBH，WonSH，LeeHS，2000a．Expressionofthechloroplast-localizedsmallheatshockproteinbyoxidativestressinrice．Gene．245：283—2931．Carranco，R．，C．Almoguera，andJ．Jordano，Aplantsmallheatshockproteingeneexpressedduringzygoticembryogenesisbutnoninducible砂heatstress．JBiolChem，1997．272(43)：P．27470-5．32．陈建南。傅鸿仪，路子显，秦环英，张磊，郭子彪，1997．HSP70反义RNA对高粱花粉的正常形成的影响．科学通报，42：1993—19933．VolkovRA，PanchukII，SchoffiF’2005．Smallheatshockproteinsaredifferentiallyregulatedduringpollendevelopmentandfollowingheatstressintobacco．PlantMolBiol，57：48750234．LiverslyMA，BrayCM，1993．Heatshockandrecoveryinagedwheataleuronelayers．SeedSciRes，3：179．18635．WehmeyerN，HernandezLD，FinkelsteinRR，VierlingE，1996．Synthesisofsmallheat-shockproteinsispartofthedevelopmentalprogramoflateseedmaturation．PlantPhysiol，l12：747—7536．AlmogueraC，JordanoJ，1992．Developmentalandenvironmentalconcurrentexpressionofsunflowerdry—seed—storedlow-molecular-weightheat-shock—proteinandLeamRNAs．PlantMolMal，19：781—79237．HelmKW：AbernathyRH，1990．HeatshockproteinandtheirmRNAsindryandearlyimbibingembryoofwheat．PlantPhysiol，93：1626338．Nieto-SoteloJ，MartinezLM，PonceGCassabGAlagonA，MeeleyRB，RibautJM，Yang＆2002．MaizeHSP101playsimportantrolesinbothinducedandbasalthermotoleranceandprimaryrootgrowth．ThePlantCell，14：162116339．张玉秀，柴团耀．HSP70分子伴侣系统研究进展，生物化学与生物物理进展，1999，26：554．55840．GioriniS．，GaliliGCharacterizationofHSP-70cognateproteinsfromwheat．TeorApplGenet，1991，82：615—62041．刘良式．植物分子遗传学．北京：科学出版社，1997，545．54742．StevensonM．A．。CalderwoodS．K．Membersofthe70．kilodaltonheatshockproteinfamilycontainahighlyconservedcalmodulin·bindingdomain．MolCellBioi，1990，10(3)：1234-12343．KimpelJA，NagaoRT，GoekjianVeta1．Regulationoftheheatshockresponseinsoybeanseedlings．JPlantPhysic!．1990．94：988．9945 44．BalerR．，ZooJ．，VoellmyREvidenceforaroleofHsp70intheregulationoftheheatshockresponseinmammaliancells．CellStressChap，1996，l：33—3945．ParsellDA．，LindquistS．111efunctionofheat2shockproteinsinstresstolerance：degradationandreactivationofdamagedprotein．AnnuRevGenet，1993，27：437-49646．耶兴元，马锋旺．植物热激蛋白研究进展，西北农业学报，2004，13(2)：109-ll47．KalinskiA．RowleyDL，LoerDS，eta1．Bindingproteinexpressionissubjecttotemporal，developmentalandstressinducedregulationinterminallydifferentiatedsoybeanorgans．Planta,1995．195：611．62l48．Bardwell，J．C．A．，Craig，E．A．1987．EukaryoticMr83，000heatshockproteinhasahomologueinEscherichiacoli．Proc．Natl．Acad。Sci．USA84：5177．8l49．BorkovichK．A．，FarrellyEw．，FinkelsteinD．B．，TaulienJ．andLindquistS．(1989)Hsp82isanessentialproteinthatisrequiredinhiigherconcentrationsforgrowthofcellsathighertemperatures．M01．Cell．Bi01．9：3919--393050．BimbyD．A．，LinkE．M．，VowelsJ．J．，Ti锄H．，ColacurcioP．’L．andThomasJ．H．(2000)Atransmembraneguanylylcyclase(DAF-11)andHsp90(DAF一21)regulateacommonsetofchemosensorybehaviorsinCaenorhabditiselegans．Genetics155：85-10451．vanderStratenA．，RommelC．，DicksonB．andHafenE．(1997)Theheatshockprotein83(Hsp83)isrequiredforRaf-mediatedsignallinginDrosophila．EMBOJ．16：1961-196952．MoranoK．A．，SantoroN．，KochK．A．andThieleD．J．(1999)Atrans—activationdomaininyeastheatshocktranscriptionfactorisessentialforcellcycleprogressionduringstress．M01．Cell．Bi01．19：402-4ll53．Blackman，R．K．，Meselson，M．1986．InterspecificnucleotidesequencecomparisonsusedtoidentifyregulatoryandstructuralfeaturesoftheDrosophilahsp82gene．J．M01．Bi01．188：499-51554．Zimmerman，J．L．，Petri，W：L．，Meselson，M．1983．AccumulationofspecificsubsetsofD．melanogasterheatshockmRNAsinnormaldevelopmentwithoutheatshock．Cell32：l161-7055．Carbajal，M．E．，Duband，J．L．，Lettre，F．，Valet，J．P．，Tanguay,R．M．1986．CellularlocalizationofDrosophila83-kilodaltonheatshockproteininnormal，heat-shocked，andrecoveringculturedcellswithaspecificantibody．Biochem．CellBi01．64：816—2556．Houry,W．A．(2001)．Chaperone—assistedproteinfoldinginthecellcytoplasm．Curt．ProteinPept．Sci．2，227-244．57．Pearl，L．H．，andProdromou，C．(2002)．Structure，function，andmechanismoftheHsp90molecularchaperone．Adv．ProteinChem．59．15‘7-l86．58．Prattw．B．andToftD．0．(1997)Steroidreceptorinteractionswithheatshockproteinandimmunophilinchaperones．Endocr．Rev．18：30每_36059．WiechH．，BuchnerJ．，ZimmermannR．andJakobU．(1992Hsp90chaperonesproteinfoldinginvitro．Nature358：169-17060．JakobU．，LilieH．，MeyerI．andBuchnerJ．(1995)Transientinteractionofhsp90withearlyunfoldingintermediatesofcitratesynthase—implicationsforheatshockinvivo．J．Bi01．Chem．270：7288-729461．SchumacherR．J．，HansenW：J．，FreemanB．C．，AlnemriE．，LitwackGandTofID．O．(1996)CooperativeactionofHsp70，Hsp90，andDnaJproteinsinproteinrenaturation．Biochemistry35：14889一1489862．ProdromouC．，RoeS．M．，O’BrienR．，LadburyJ．E．，PiperP．W．andPearlL．H．(1997)IdentificationandstructuralcharacterizationoftheATP／ADP-bindingsiteintheHsp90molecularchaperone．Cell90：65-7563．DuttaR．andInouyeM．(2000)GHKL，anemergentATPase／kinasesuperfamily．TrendsBiochem．Sci．46 25：24—2864．Obermannw．M．J．，SondermannH．，RussoA．A．，PavletichN．P-andHartlF．U．(1998)InvivofunctionofHsp90isdependentonATPbindingandATPhydrolysis．J．CellBi01．143：901-91065．OwenB．A．，SullivanW．P．，FeltsS．J．andTortD．O．(2002)Regulationofheatshockprotein90(HSP90)ATPaseactivitybysequencesinthecarboxylterminus．J．Bi01．Chem．277：7086-709166．McLaughlinS．H．，SmithH．W：andJacksonS．E．(2002)StimulationoftheweakATPaseactivityofhumanHsp90byaclientprotein．J．M01．Bi01．315：787-79867．ScheibelT．，SiegmundH．I．，JaenickeR．，GanzP．，LilieH．andBuchnerJ．(1999)ThechargedregionofHsp90modulatesthefunctionoftheN．terminaldomain．Proc．Natl．Acad．Sci．USA96：1297-130268．ScheuflerC．，BrinkerA．，BourenkovG，PegoraroS．，MoroderL．，BartunikH．eta1．(2000)StructureofTPRdomain-peptidecomplexes：criticalelementsintheassemblyoftheHsp70-Hsp90multichaperonemachine．Cell10l：199--21069．MarcuM．G，ChadliA．，BouhoucheI．，CatelliM．andNeckersL．M．(2000)Theheatshockprotein90antagonistnovobiocininteractswithapreviouslyunrecognizedATP-bindingdomaininthecarboxylterminusofthechaperone．J．Bi01．Chem．275：37181_3718670．Gamier,C．，eta1．，BindingofATPtoheatshockprotein90：evidenceforanATP—bindingsite胁theC-terminaldomain．JBiolChem．2002．277(14)：P．12208-14．71．ProdromouC．，RoeS．M．，PiperP．W．andPearlL．H．(1997)AmolecularclampinthecrystalstructureoftheN-terminaldomainoftheyeastHsp90chaperone．NatureStruct．Bi01．4：477-48272．McLaughlin，s．H．，H．w：Smith，andS．E．Jackson，StimulationoftheweakATPaseact加ityofhumanhsp90砂aclientprotein．JMolBiol，2002．315(4)：P．787-98．73．Meyer,P．，eta1．，Structuralandfunctionalanalysisofthemiddlesegmentofhsp90：implicationsforATP砂drolysisandclientproteinandcochaperoneinteractions．MolCell，2003．1l(3)：p．647-58．74．RamseyA．J．，RussellL．C．，WhittS．R．andChinkersM．(2000)Overlappingsitesoftetratricopeptiderepeatproteinbindingandchaperoneactivityinheatshockprotein90．J．Bi01．Chem．275：17857-1786275．ProdromouC．，SiligardiG，O’BrienR．，WoolfsonD．N．，ReganL．，PanaretouB．eta1．(1999)RegulationofHsp90ATPaseactivitybytetratricopeptiderepeat(TPR)-domainco—chaperones．EMBOJ．18：754—76276．YoungJ．C．，Obermannw-M．J．andHartlEU．(1998)SpecificbindingoftetratricopeptiderepeatproteinstotheCterminal12-kDadomainofhsp90．J．Bi01．Chem．273：18007—1801077．H0hfeldJ．，CyrD．M．andPattersonC．(2001)Fromthecradletothegrave：molecularchaperonesthatmaychoosebetweenfoldinganddegradation．EMBORep．2：885—89078．BoseS．，WeiklT．，BfiglH．andBuchnerJ．(1996)ChaperonefunctionofHsp90一associatedproteins．Science274：1715-171779．ProdromouC．，PanaretouB．，ChohanS．，SiligardiG，O’BrienR．，LadburyJ．E．eta1．(2000)TheATPasecycleofHsp90drivesamolecular‘clamp’viatransientdimerizationoftheNterminaldomains．EMBOJ．19：4383-439280．StebbinsC．E．，RussoA．A．，SchneiderC．，RosenN．，HartlF．U．andPavletichN．P．(1997)CrystalstructureofanHsp90-geldanamycincomplex：targetingofaproteinchaperonebyanantitumoragent．Cell89：239-25081．ProdromouC．，SiligardiG，O’BrienR．，WoolfsonD．N．，ReganL．，PanaretouB．eta1．(1999)RegulationofHsp90ATPaseactivitybytetratricopeptiderepeat(TPR)-domainco-chaperones．EMBOJ．18：754_．76282．ChenS．andSmithD．F．(1998)Hopasanadaptorintheheatshockprotein70(Hsp70)andhsp9047