凡纳滨对虾血蓝蛋大亚基启动子的研究

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1、汕头大学硕士学位论文学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编

2、论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。本论文属于：保密（），在年内解密后适用本授权声明。不保密（）。（请在以上括号内打“√”）作者签名：导师签名：________日期：年月日日期：年月日汕头大学硕士学位论文摘要血蓝蛋白是存在于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，近年来研究表明，血蓝蛋白是一种具有多种免疫学活性的多功能蛋白。然而迄今为止，其启动子的序列、结构等尚不清楚。为此，本研究采用现

3、代分子生物学策略，对其进行了较为深入、系统的研究，所获主要研究结果如下：1、血蓝蛋白大亚基启动子序列的克隆首先，采用染色体步移技术克隆凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血蓝蛋白大亚基（命名为HcL）部分5'非翻译区序列，结果成功获得一条大小为949bp的条带（命名为p949）。继而，设计特异性引物对所得片段进行特异性扩增、测序分析，序列比对发现其与p949具有99%的相似性。最后，选用TFSEARCH软件对该序列进行生物信息学分析，结果显示，p949可能含有TATA-Box、H

4、SF、Dfd、CF-Ⅱ等顺式作用元件。由此提示，p949应该含有凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基启动子序列。2、HcL启动子活性的检测及其核心启动子区、位点的确定首先，运用基因克隆技术将p949与表达载体pGL3-Basic相连，并将重组表达载体（pGL3-p949）转染果蝇S2细胞，采用萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其转录活性。结果发现，实验组报告基因活性为阴性对照组的1.49倍（p<0.001）。由此说明，所获得的序列具有一定的启动子活性。然后，基于MEME软件、BDGP-promoter软件

5、分析结果，采用PCR定向亚克隆策略，构建4个覆盖p949序列的缺失片段，将其分别命名为D1（缺失-267~-40）、D2（缺失-267~+11）、D3（缺失-267~+243）、D4（缺失-267~+367）。荧光素酶报告基因检测活性发现，D1至D4活性依次为阳性对照组的84.4%、82.6%、68.9%和69.3%，其中D3报告基因活性最低（p<0.001），提示p949中的“-267~+243”区域可能为血蓝蛋白大亚基核心启动子区。最后，运用BDGP-promoter软件预测核心启动子区的核

6、心启动子位点，结果表明，在-267~+243区域含有Promoter1和Promoter2两个可能的核心启动子位点，其中-39~+10位点含有典型的TATA-Box核心元件。在此基础上，进一步采用重叠PCR技术对TATA-Box核心元件进行删除突变，并构建突变子1汕头大学硕士学位论文pGL3-p949D。报告基因活性比对发现，pGL3-p949D突变子活性降低至阳性对照的73.9%（p<0.01）。由此提示，TATA-Box核心元件可能为p949发挥转录活性的核心启动子位点之一。综上所述，本研究

7、主要获得凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基部分启动子序列，并对其核心启动子区、核心启动位点进行了较深入的探索。所获研究结果为阐明对虾血蓝蛋白的基因转录表达调控机制，揭示对虾免疫防御机制等提供了良好的科学依据，对丰富对虾免疫学研究具有一定的理论意义与潜在的应用价值。关键词：凡纳滨对虾；血蓝蛋白；启动子；核心启动子区；核心启动位点2汕头大学硕士学位论文AbstractHemocyaninisacopperproteinpresentinthehemolymphofbothmollusksandarthropo

8、ds.Lately,itwasdemonstratedthathemocyaninisamultifunctionalprotein,especiallyparticipatinginmultiplerolesofimmunedefense.However,littleisknownaboutitspromoter.Thus,inthisstudy,anattemptwasmadetoinvestigatethesequenceandcoreregionsofhemocyaninpromoter