杆菌比色检测的适配体生物传感器研究

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1、’■量驴’箝矗德蠡盈礓噩H_铲§强，qd盥r7—Ⅱrk誉皤孽革胃癌省囊∥譬’-：，鲈‘．-盎筘，t≯’}-$^-Ir前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．01第一部分肠致病性大肠杆菌脂多糖适配体的截短设计与结合实验⋯⋯⋯⋯031．引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．032．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．083．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．154．分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27第

2、二部分基于适配体．聚丁二炔纳米生物传感器的肠致病性大肠杆菌比色检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．312．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯414．分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．47全文小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51附录

3、I⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56附录II⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57附录III⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．77温州医学院硕士学位论文肠致病性大肠杆菌比色检测的适配体生物传感器研究中文摘要目的：通过对肠致病性大肠杆菌脂多糖特异性适配体的截短

4、设计，初步研究适配体的序列、结构与功能之间的关系；并将截短后的肠致病性大肠杆菌脂多糖特异性适配体修饰于聚丁二炔纳米囊泡表面，从而构建一种可以快速比色检测肠致病性大肠杆菌的适配体生物传感器。方法：1．聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征：以PCDA单体、DMPC和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoil，EPEC)脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)为膜材，采用探头超声法制备三种不同体系的聚丁二炔纳米囊泡，分别是纯PDA囊泡、PDA／DMPC混合磷脂囊

5、泡以及PDA／DMPC／LPS混合磷脂囊泡。采用透射电镜负染技术，对这三种囊泡进行形貌表征；采用紫外．可见光吸收光谱技术，对这三种囊泡进行特征吸收峰表征；采用鲎试验，对LPS是否插入囊泡及插入方向进行验证。2．肠致病性大肠杆菌脂多糖特异性适配体的截短设计与结合实验：对已有的肠致病性大肠杆菌脂多糖适配体序列进行截短设计，并将截短后的适配体通过酰胺化反应修饰到聚丁二炔纳米囊泡的表面，实现生物传感器的组装以及其对肠致病性大肠杆菌脂多糖的特异识别。采用ELISA方法和透射电镜负染技术等对适配体与脂多糖之间的

6、特异性结合作用进行验证。3．适配体．聚丁二炔纳米生物传感器的肠致病性大肠杆菌比色检测：利用适配体与肠致病性大肠杆菌之间的特异性结合以及结合后所引起的聚丁二炔纳米囊泡颜色变化和比色响应值(CI蝴)改变来定性或定量检测溶液中的肠致病性大肠杆菌。并通过透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜对聚丁二炔纳米囊泡或适配体与肠致病性大肠杆菌之间的作用进行验证。结果：1．聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征：经透射电镜表征证实，纯PDA体系、PDA／DⅧC混合磷脂体系以及PDA／DⅧC／LPS混合磷脂体系均能形成囊泡，直径30"

7、--'100nm左右；经254nm紫外线照射，各种体系均从无色转变为蓝色；经鲎试验证实，PDA／DMPC／LPS混合磷脂囊泡的内毒素活性很低，说明绝大部分LPS成功插入囊泡且LPS的特异多糖部分分布在囊泡表面。2．肠致病性大肠杆菌脂多糖特异性适配体的截短设计与结合实验：经紫外．可见光吸收光谱分析证实，成功将适配体修饰到聚丁二炔纳米囊泡表面，其修饰效率大于85％；经ELISA方法和透射电镜负染技术，以及脂多糖修饰聚丁二炔纳米囊泡引起的适配体．聚丁二炔纳米生物传感器明显颜色变化和CI泓增大等多项证实，成

8、功获得具有结合肠致病性大肠杆菌功能的适配体截短序列。3．适配体．聚丁二炔纳米生物传感器的肠致病性大肠杆菌比色检测：成功构建一种可以快速比色检测肠致病性大肠杆菌的适配体生物传感器，并经透射电镜和激光共聚焦显微镜证实。其不需要特殊仪器，操作简便，检测时间短，仅需30min；灵敏度较高，检出限为105CFU／mL，线性范围为105～108CFU／mL；稳定性高，对106CFU／mL菌液检测的相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)为6．08