蛋白与核酸作用检测6-RNA-蛋白 Pull-Down

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1、编号：3-6主题：RNA-蛋白Pull-Down概述：此方法是利用脱硫生物素末端标记的RNA和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA结合蛋白（RBP）。RNA-蛋白Pull-Down的原理是将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，用于下游分析。目的：寻找与RNA相互作用的蛋白质步骤：(1)RNA结合到链霉亲和素磁珠1)加入50μl链霉亲和素磁珠到1.5ml的EP管，将EP管放入磁力架，吸去液体；

2、2)加入50μlpH7.520mMTris重悬磁珠；3)重复步骤1，2；4)将EP管放入磁力架，吸去液体；5)加入50μl1×RNACaptureBuffer重悬磁珠；6)加入50pmolRNA探针到磁珠中，混匀；7)室温孵育30min；(2)蛋白结合到RNA1)加入50μl链霉亲和素磁珠到1.5ml的EP管，将EP管放入磁力架，吸去液体；2)加入50μlpH7.520mMTris重悬磁珠；3)重复步骤1，2；4)将EP管放入磁力架，吸去液体；5)加入100μl1×Protein-RNABindingBuffer到磁珠，混匀；6)准备Protein-RNABindingReactio

3、nMasterMix；7)将EP管放入磁力架，吸去液体。加入100μlMasterMix，混匀；8)4℃孵育60min；(3)洗脱RNA-Bindingprotein1)将EP管放入磁力架，吸去液体；2)加入100μl1×washbuffer，混匀，将EP管放入磁力架，吸去液体；3)重复步骤1，2；4)加入50μlElutionbuffer，混匀，37℃孵育30min；5)将EP管放入磁力架，收集液体，-20℃保存。(4)Western-blot或质谱分析。流程图：