蛋白与核酸作用检测4-RNA结合蛋白免疫沉淀

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1、编号：3-4主题：RNA结合蛋白免疫沉淀概述：RIP技术（RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-

2、蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。目的：研究细胞内RNA与蛋白结合情况。步骤：1.细胞裂解液获取：A.单层细胞或者贴壁细胞处理1.冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次；2.加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendorf管；3.1500r

3、pm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞；4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min；5.每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃；B.悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解；C.组织样品处理：1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次；2.加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数；3.1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞；4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min；5.每管分装200μl细胞裂

4、解液，贮存于-80℃；2.磁珠的准备：1.重悬磁珠；2.标记实验所需的eppendorf管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3.吸取50μl重悬后的磁珠悬液于每个eppendorf管；4.每管加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡；5.将eppendorf管置于磁力架上，左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复1次；6.用100μl的RIPWashBuffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中；7.室温孵育30min；8.将eppendorf管置于磁力架上，弃上清

5、；9.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次；10.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后置于冰上；3.RNA结合蛋白免疫沉淀：1.准备RIPImmunoprecipitationBuffer；2.将前上步的eppendorf管放磁力架上，去上清，每管加入900μlRIPImmunoprecipitationBuffer；3.迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总

6、体积为1ml；4.4℃孵育3h至过夜；5.短暂离心，将eppendorf管放在磁力架上，弃上清；6.加入500μlRIPWashBuffer，涡旋震荡后将eppendorf管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次。4.RNA纯化1.准备ProteinaseKBuffer。每个样品需150μl；2.用150μlProteinaseKBuffer重悬上述磁珠-抗体复合物；3.55℃孵育30min；4.孵育完之后，将eppendorf管置于磁力架上，将上清液吸入一新的eppendorf管中；5.于每管上清

7、液中加入250μlRIPWashBuffer；6.于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min；7.小心的吸取350μl上层水相，吸入另一新的eppendorf管；8.于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min；9.小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的eppendorf管；10.每管加入50μlSaltSolutionⅠ，15μlSaltSolutionⅡ，5μlPrecipitateEnhancer，

8、850μl无水乙醇(无RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜；11.14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清；12.用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干；13.10-20μlDEPC水溶解，-80℃保存，送测序。流程图：