蛋白与核酸作用检测2-EMSA

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1、编号：3-2主题:凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）概述:凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。目的：1.用于研究特定的转录因子以及转录因子所结合的顺式作用元件；2.用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性；3.评估突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响；

2、4.用于研究DNA-footprinting。原理：通常将纯化的蛋白和细胞提取液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（

3、非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。步骤：使用Pierce生产的试剂盒，按照说明书操作。1、寡聚核苷酸的标记(1)冰上融化标记试剂盒所有试剂(TdT除外)；(2)使用前，用lxTdTreactionbuffer稀释TdT贮液，工作浓度为2U/μl；(3)按下表加入试剂(总体积50μl):UltraPurewater25μl5xTdTReactionBuffer10μlSampleoligoDNA(lμl)5μl(finalconcentration100nM)Biotin-N4-CTP(

4、5μl)5μl(finalconcentration0.5μM)DilutedTdT(2U/μl)5μl(finalconcentration0.2U/μl)(4)37C°30min；(5)加2.5μl0.2MEDTA终止反应；(6)加50μl氯仿:异戊醇(24：1)抽提TdT，剧烈震荡,高速离心，取上层水相；(7)检测标记效率。(8)互补连退火，退火后的用于EMSA分析或-20C°冻存。2、EMSA实验步骤(1)配制电泳胶：丙烯酰胺的浓度为4-6%，100V电压预电泳；(2)结合反应按下列顺序加试剂(总体积20μl):UltraPurewaterdependent10

5、xBindingBuffer2μlPoly(dIdC)lμlUnlabeledtagetDNAdependentProteinExtract3-5μgBiotinEnd-labeledTagretlμl(Finalconcentration20fM/μl)Antibody4μg(3)电泳60V电压电泳，溴酚蓝前沿至胶的2/3处停止电泳；(4)转膜380mA电流，转膜lh；(5)检测a37C°融化Blockingbuffer和4xWashingBuffer；b加BlockingBueffr，室温轻摇15min；c制备Conjugate/blockingbuffersolu

6、tion；d倒出BlockingBuffer，加入Conjugate/blockingbuffersolution，室温轻摇15min；e制备lxWashingBuffer；f将膜转入一干净的容器，用lxWashingBuffer洗涤4次，每次5min，室温轻摇；g将膜转入一干净的容器，加substrateEquilibrationBuffer，室温轻摇5min；h制备substrateworkingsolution(避光)；i取出膜，在纸巾上吸去多余液体，放入干净容器，加substrateworkingsolution，放置5min；j取出膜，在纸巾上吸去多余液体，用

7、保鲜膜包好,不要有褶皱；k暗室中曝光，照相。流程图：