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时间:2019-02-14
《bacillus+subtilis异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型指导途径改造》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名:签字日期:年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,并采用影
2、印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名:导师签名:签字日期:年月日签字日期:年月日摘要本研究借鉴合成生物学方法构建了Bacillussubtilis异丁醇合成菌株;围绕―构建模型—预测靶点—指导实践‖的系统代谢工程改造策略,建立了B.subtilis异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型指导的理性代谢途径改造方法,提高了菌株的异丁醇合成能力。为了获得稳定的B.subtilis异丁
3、醇合成菌株,本工作构建了由B.subtilis强启动子P43、Lactococcuslacticskivd基因与Saccharomycescerevisiaeadh2基因组成的异源Ehrlich途径,并将其整合至宿主染色体上。微氧条件下(20%装液量,240rpm,37°C,密封瓶口),重组菌株BSUL02-1的摇瓶产量达到0.93±0.12g/L异丁醇。为了强化该菌株的产醇能力,引入由P43、B.subtilisalsS基因、CorynebacterialglutamicumilvC和ilvD
4、基因组成的异源α-酮异戊酸合成途径,获得菌株BSUL03。在微氧条件下,以初始浓度20g/L葡萄糖为底物,18h补加葡萄糖至初始浓度,菌株的摇瓶产量达到2.62±0.19g/L。为了有效提高BSUL03的异丁醇合成能力,本研究建立了模型指导的菌株理性代谢改造方法。首次采用基元模式法分析了B.subtilis异丁醇合成菌株基因组尺度代谢网络模型,获得239个合理的异丁醇合成模式。在此基础上,根据通量相关性与通量灵活度分析,预测出12个能够显著影响菌株异丁醇合成的靶基因。为了考察模型预测的准确性,选
5、择ldh与pdhC敲除靶点,分析了模拟突变菌株的胞内代谢通量分布。通过构建双缺失突变菌株BSUL05的实验,验证了在双阶段分批补料(好氧-微氧,40%装液量,初始葡萄糖浓度10g/L,低于1g/L时补加1.6mL500g/L葡萄糖)条件下,BSUL05的发酵罐产量较BSUL03提高70%,约为5.5±0.3g/L异丁醇;得率提高83%至0.31±0.02C-mol异丁醇/C-mol葡萄糖,达到理论得率(0.59C-mol/C-mol)的53%,表明该模型能够准确预测靶标基因并指导菌株改造。在模型
6、预测指导下,本工作对BSUL05进行了理性改造以提高菌株的异丁醇合成能力。通过敲除pgi基因、过表达B.subtiliszwf基因和EscherichiacoliudhA基因,构建了菌株BSUL08。该菌株NADPH浓度提高为亲株BSUL05的2.6倍,且胞内还原力得到良好平衡。在双阶段分批补料条件下,BSUL08的发酵罐产量较BSUL05提高11%,达到6.12±0.53g/L异丁醇;得率提高19%达到0.37C-mol异丁醇/C-mol葡萄糖,为理论得率的63%。该结果表明了代谢网络模型对菌
7、株理性改造的指导意义,揭示了胞内还原力状态对异丁醇生物合成的重要性。关键词:枯草芽孢杆菌异丁醇合成生物学代谢网络模型靶点预测理性改造ABSTRACTIsobutanol-producingBacillussubtiliswasengineeredviasyntheticbiologyinthepresentwork.Arationalstrainimprovementapproachwasestablishedbytakingthe―modelconstruction-targetpredict
8、ion-experimentguidance‖artofsystemsmetabolicengineeringintoconsideration,whichimprovedtheisobutanolbiosyntheticcapacityoftheengineeredstrains.Inordertoobtainthestableisobutanol-producingB.subtilis,anefficientheterologousEhrlichpathwaywasconstructedby
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