核酸检测篇8-Northern blot

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1、编号：2-8主题：Northernblot概述：Northernblot（诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。Northernblot在1977年由斯坦福大学JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark发明。Northernblotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southernblot（依据生物学家EdwinSouthern名字来命名）来

2、命名，Southernblot主要用来对DNA进行分析。目的：Northernblot可用来检测不同组织、器官、生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达模式，还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而进行转膜和用探针进行杂交检测RNA的表达水平。步骤：1、总RNA提取；2、变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC水12.4ml

3、，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min；3、样品制备：取总RNA约20-30μg，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。4、电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2小时左右），电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。5、将RNA从

4、变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜；6、使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾；7、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5min，以去除膜上残留的凝胶；8、将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA；9、膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用；10、探针标记；11、预杂交：将膜的反面紧贴杂交瓶，加入预杂交液5ml，42℃预杂交3hr；12.杂交：将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加入到预杂

5、交液中，42℃杂交16hr；13.洗膜；14.压片。流程图：