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1、核酸杂交检测技术核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速诊断。杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待测样品中的病毒核酸,杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号,则说明样品中存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在。待测的病毒核酸可以从病料中提取,也可以从纯化的病毒粒子提取。提取后可在膜上与探针杂交(固相杂交)。或直接在试管的杂交液中杂交(液相杂交),此外,也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸进行杂交(原位杂交)。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病
2、毒诊断的几种杂交方法。(一)建立杂交体系核酸杂交是多种环境因素与二条互补核酸链综合作用的结果,它有较高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系,获得理想结果的基础。1、温度杂交反应中,双链核酸的变性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键的因素之一。杂交反应通常在低于解链温度(Tm值)15～25℃的条件下进行。Tm值受核酸链组成(G+C)、溶液的离子强度、pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。在杂交体系不含变性剂的情况下,DNA之间的杂交反应通常在68℃进行,当含50%变性剂甲酰胺,则在42℃进行
3、。2、pH值杂交体系的pH在5～9的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在pH65～75之间进行。较高的pH值产生更严格的杂交条件。3、盐离子浓度体系中往往加入单价离子的盐,因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团发生静电反应,所以能降低核酸链之间的静电排斥,维持双链DNA的稳定性。盐浓度增加,稳定性提高。杂交体系中通常采用6倍SSC(1倍SSC为015mol/LNaCl和0015mol/L柠檬酸钠，pH70)缓冲液。4、变性剂杂交体系中加入变性剂可降低Tm值,所以杂交可在更低的温度下进行。常用变性剂是甲酰胺。5、DNA浓度浓度愈高,
4、复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针,还应尽量减少杂交体积,一般每百cm2滤膜用25ml杂交液。6、探针长度溶液中DNA复性率与片段长度的平方根成正比。所以用长的探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针,以减少探针进入细胞并扩散到靶核酸的阻力。7、硫酸葡聚糖在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA探针分子,从而浓缩探针,促进二条核酸链间的缔合。其10%的浓度可提高杂交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深,所以一般在探针浓度过低的情况下才使用。8、杂交时间它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影响,较短的探针、较高的
5、探针浓度和较小的杂交体积,需要较短的杂交时间。一般来说,杂交时间通常在2～16小时。9、预杂交在杂交前进行预杂交,封闭非特异的DNA结合位点,降低非特异杂交,是杂交的前提。常用的封阻试剂有非特异性的DNA(鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等)。10、碱基错配杂交中碱基错配将明显提高杂交本底,从而影响杂交结果的判定。因此杂交可在更为严格的条件下进行,如低于Tm值15℃的温度下杂交。11、漂洗杂交后的漂洗是减少非特异杂交,降低本底的关键步骤。通常用较低盐浓度(01倍SSC)的缓冲液在
6、较高温度下(如68℃)漂洗杂交膜。(二)核酸打点杂交1、操作步骤核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法,是作为诊断目的的首选方法。它是将一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打点在固相支持膜(通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,然后与放射性或非放射性标记的(DNA或RNA)探针进行杂交,杂交后通过放射自显影(检测放射性探针)或显色反应(检测非放射性探针)检测杂交信号。阳性杂交信号表明病毒核酸的存在,检测出病毒核酸就充分说明发生了病毒感染。具体操作方法如下:①裁剪一张大小适度的硝酸纤维素膜(NC膜),将膜在去离子水中湿透(不能完全湿透的膜不宜使用),再置
7、20倍SSC中浸泡30分钟,然后置滤纸上,室温晾干;②取变性的病毒核酸(DNA或RNA)1～5μl点样于上述处理的NC膜上,同时点上探针同源核酸(作为阳性对照)和非同源核酸(作为阴性对照);③室温干燥后,将点样的NC膜置80℃干烤固定2小时;④点样膜用6倍SSC,01%十二烷基肌氨酸钠,002%SDS,1%封阻试剂(一种特殊提纯和处理的脱脂牛奶粉,柏林格公司生产)的预杂交液于68℃预杂交4～6小时。每100cm2膜用至少20ml预杂交液;⑤将膜用杂交液(预杂交液中加入20～80ng/ml变性的探针)于68℃杂交12～16小时。每100cm2
8、膜用25ml杂交液;⑥室温下用2倍SSC,01%SDS溶液洗
