核酸分子的杂交技术

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1、反式作用因子特点：①三个功能结构域：DNA识别结合域；转录活性域；结合其他蛋白的结合域②能识别并结合顺式作用元件③正调控与负调控第十章核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本方法探针的标记第一节核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。探针HybridizationofNucleicAcidsRNADNA1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridizationJuangRH(2004)BC

2、basics探针一、DNA变性与复性1.DNA变性①定义：氢键断裂，单链②方法:热变性:90~100℃熔解温度(Tm)酸碱变性:常采用碱变性化学试剂变性;尿素、甲醛等2.DNA复性(退火)DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA二、影响杂交的因素1.核酸分子的浓度、长度和复杂性2.离子强度3.温度4.杂交促进剂：硫酸葡聚糖等5.非特异性杂交反应预杂交：用鲑鱼精子DNA封闭非特异性杂交位点第二节分子杂交的基本方法Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交固相杂交一、S

3、outhernblotting1975年，英国EdwenSouthern创建检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。应用：基因组DNA的定性和定量分析基因诊断、分子克隆、法医学等Southernbloting的主要步骤1.待测DNA样品的制备、酶切2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜(印迹)：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测步骤1.待测DNA样品的制备、

4、酶切DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。2.待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳bp—1534—994—695—515—377—237ABCM琼脂糖凝胶电泳3.凝胶中DNA的变性：碱变性4.Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法电转印法5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜)6.杂交结果的检测Souhternblotting二、Northern印迹杂交(Nort

5、hernbloting)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNA，不需用限制酶消化RNA电泳转膜：电泳结束后不需变性应用：检测外源基因在宿主中能否转录RNA提取1.样品细胞的有效破碎；2.使核蛋白复合体变性；3.对内源RNA酶的有效抑制；4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；Northernblotting三、斑点印迹杂交(dotbloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品应用：确定DNA样品之间的同源性四、核酸原位杂交(

6、insituhybridization)1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。2.特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测1.荧光染色体原位杂交(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直

7、接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。2.多色荧光染色体原位杂交(multicolorFISH;mFISH)3.比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)由原位杂交发展起的一些新技术3.比较基因组原位杂交(ComparativeGenomicHybridization；CGH)利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的GenomicDNA，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝

8、数变化。CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。五、Western印迹法(Westernbloting)检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主