重组毕氏酵母发酵过程的建模及优化

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1、摘要重组毕氏酵母发酵过程的建模及优化人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的多肽链，分子量为66．5kDa。它是人体血浆的主要组成部分，浓度高达42gL～。它在人体内是类固醇激素、氨基酸等几种重要生理物质的可溶性载体，同时在维持血液正常渗透压方面也起着重要作用。临床上，人血清白蛋白主要用作血浆容量扩充剂，抢救休克、烧伤的病人，是极为重要的人体蛋白药物。目前，人血清白蛋白制品主要从人血浆或胎盘中分离生产，产品被血液病原病毒污染的几率较大。随着生物技术的发展，这种传统的生产方式受到了基因工程酵母发酵生产重组人血清蛋白(rHSA)的挑战。近年来，毕氏酵母由于其自身的竞

2、争优势，正受到人们越来越多的关注。相对其它酵母而言，毕氏酵母表达系统具有表达量高、生产成本低、产物分泌到胞外及易于后续修饰等优点。截至目前，其表达产品已有300多种。虽然发酵过程中产物产量主要由菌株特性所决定，但过程的优化控制同样是一条降低成本、提高产率的重要途径。本文以重组毕氏酵母发酵生产人血清白蛋白为例，对发酵过程的建模及优化控制进行了研究。主要工作内容包括：·重组毕氏酵母宏观动力学模型基于对毕氏酵母中基质代谢途径的分析，建立了毕氏酵母宏观动力学模型。该模型描述了毕氏酵母中物质流和能量流的平衡关系。利用该模型可以解得比碳源消耗速率、比生长速率、比乙酰辅酶

3、A生成速率、比氧消耗速率等关键的反应速率。进一步，将该模型与生物反应器模型相结合，获得了操纵变量(补料速上海交通大学博士学位论文率)和状态变量(细胞浓度、基质浓度、蛋白浓度和发酵液体积)之间的关系。此外，文中还对甲醇初期细胞干重下降的现象进行了探讨，并对尾气中二氧化碳的浓度进行了估算。·毕氏酵母细胞循环模型在面包酵母细胞循环模型的基础上，建立了毕氏酵母的细胞循环模型，模型中考虑了发酵过程中细胞平均体积发生变化的影响。然后，将细胞循环模型与宏观动力学模型相结合，形成了完整的毕氏酵母动力学一细胞循环组合模型。·模型的实验验证利用大量的实验数据对上述模型进行了验证

4、。结果表明，宏观动力学模型可以较好地描述细胞干重和蛋白浓度。关于对细胞循环过程的描述，细胞数浓度的仿真结果与实测数据十分吻合；对带芽细胞分率变化趋势的描述令人满意，但定量描述存有欠缺。进而，对模型参数进行了灵敏性分析，并将不灵敏参数设为定值，从而减少了待辨识模型参数的个数，增强了模型的实用性。·甲醇补料策略的优化在宏观动力学模型的基础上，优化了甲醇补料策略。将产物生成期的恒定流加速率补料策略改进为恒定比生长速率补料策略，提高了蛋白产率。进一步，研究了恒定比生长速率补料策略下比生长速率的最优控制范围。另外，文中还对甲醇期初始细胞干重对蛋白产量的影响进行了探讨。

5、·甘油补料策略的优化在宏观动力学模型和细胞循环模型的基础上，对甘油补料策略进行了优化。优化控制的目标分别是甘油期末端的带芽细胞分率的极小化和极大化。进一步的实验结果表明，带芽细胞分率极小化补料策略对提高蛋白产率有利。关于细胞平均体积对蛋白产率的影响，文中进行了初步探讨。H摘要·最优补料策略的确定综合以上因素，确定了重组毕氏酵母生产人血清白蛋白发酵过程的优化补料方案：带芽细胞分率极小化的甘油补料策略+恒定比生长速率的甲醇补料策略。与标准补料策略相比，该方案可以把160小时处的蛋白产率提高大约40％。关键词：毕氏酵母，补料分批发酵，重组人血清白蛋白，建模，补料策

6、略，产率优化III上海交通大学博士学位论文MODELINGANDOPTIMIZATIONINRECOMBINANTPichiapastorisCULTIVATIONABSTRACTHumanserulTlalbumin(1iSA)isthemajorproteincomponentofhumanplasma．Itconsistsofasinglenon-glycosylatedpolypeptidechainof585aminoacidswithamolecularweightof66．5kDa．HSAcontributessignificantlytoco

7、lloidosmoticbloodpressureandaidinthetransport，distribution，andmetabolismofmanyendogenousandexogenousligands．Itisalsousedwidelyinplasmaexpandersforthetreatmentofshockandbums，andtocompensateforbloodlossesasaresultofsurgery,accidents，orhemorrhages．Uptonow,HSAhasbeenproducedbyfractiona

8、tionofwholebloodorhumanpla