毕赤酵母重组菌gs115-ch-glu发酵培养基设计及发酵条件优化

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1、毕赤酵母重组菌GS115-Ch-Glu发酵培养基设计及发酵条件优化-农学论文毕赤酵母重组菌GS115-Ch-Glu发酵培养基设计及发酵条件优化冯爱娟１，２，吴酬飞３，王江海３，邓毛程１，２（１．广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广州５１０３００；２．广东高校特色调味品工程技术开发中心，广州５１０３００；３．中山大学海洋学院，广州５１０００６）摘要：以毕赤酵母重组菌（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ为研究对象，进行了亚麻子发酵脱毒工艺的研究，并对重组菌的发酵培养条件进行优化。结果表明，毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ发酵扩大培养的培

2、养基最佳碳源为２．５％玉米淀粉，最佳氮源为５.0％黄豆粕。优化后的基础发酵培养基发酵条件为温度２８℃、转速２５０ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ｈ、初始ｐＨ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ｍＬ／２５０ｍＬ。在此最佳发酵条件下，菌体产量为９．０×１０１０个／ｍＬ。关键词：毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）；发酵条件；优化中图分类号：Ｑ８１５文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1155-04DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.032收稿日期：２０１４－１２－１６基金项目：广东高校特色调味品工程技

3、术开发中心建设项目（ＧＣＺＸ－Ｂ１１０３）；广东轻工职业技术学院校级项目（ＫＪ２０１１０７）作者简介：冯爱娟（１９７６－），女，湖北荆门人，讲师，主要从事微生物发酵方面的研究，（电话）１３４５０２２３２９６（电子信箱）２００５１０２０３７＠ｇｄｉｔｃ．ｅｄｕ．ｃｎ；通信作者，邓毛程，教授，博士，主要从事生物发酵、海洋微生物及表面活性剂方面的研究，（电话）１３９２４１８５４４９（电子信箱）ｄｅｎｇｍｃ＠１６３．ｃｏｍ。亚麻子含多功能活性物质，其营养价值极高且具有多种临床应用价值。因此，亚麻子成为功能食品领域的研究热点，冷榨亚麻子油含有丰富的α－亚麻酸，是补充亚麻酸

4、的最有效方法，因此亚麻子是一种潜在的优良油脂原材料。但亚麻子中所含的生氰糖苷存在很大毒性，大大降低了亚麻子在粮油加工业的使用范围和利用价值。目前，亚麻子的脱毒方法主要是通过物理和化学的处理方法，但这些方法存在脱毒率较低、成本较高、难以实现产业化、溶剂残留安全风险等问题，并且会影响亚麻子中的营养成分，降低了营养价值［１］。微生物法脱毒因其作用条件温和、脱毒成本低、安全等优点［２］越来越受到生物研究领域的关注，但微生物自身代谢和繁殖产生的酶活力低，脱毒效果较差，脱除率最高为７７％［３，４］。为此，中山大学海洋学院成功构建了分泌融合表达氰化物水合酶和β－葡萄糖苷酶的基

5、因工程菌——毕赤酵母重组菌（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ，该工程菌株具有强氰根吸收能力和高效生氰糖苷降解能力，可使生氰糖苷中的ＣＮ－高效解离成ＨＣＮ，又能将游离的ＨＣＮ作为惟一碳氮源［５］。本研究利用已经构建好的毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ菌种进行发酵培养基的设计，并对其发酵条件进行优化，以期发酵产量达到工业化生产水平的要求。１材料与方法１．１材料供试菌株：毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ菌种，由中山大学海洋学院王江海实验室构建并保存。培养基成分：碳源包括葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油；氮源包括蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉

6、子粉。种子培养基：２％胰蛋白胨、１％酵母提取物、１．３４％ＹＮＢ（无氨基酵母氮源）、１％甘油、４×１０－５％生物素，加入缓冲溶液，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ即得到ＢＭＧＹ液体培养基。１．２方法１．２．１毕赤酵母重组菌种子液的培养取活化后的酵母菌１环，接种于１５０ｍＬ液体种子ＢＭＧＹ培养基中，然后进行膜过滤；放入摇床，在３０℃，２５０ｒ／ｍｉｎ的转速下培养２４ｈ备用。１．２．２碳源的确定分别以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油为碳源，保持其他培养基成分不变进行培养选择出最佳碳源。然后将最佳碳源按照２．０％、２．５％、３．０％３种不同比例进行培养基配制确定最佳使用比例。在培养

7、过程中（０～４８ｈ）每隔３ｈ取样测定ＯＤ值（为保证数据的准确，进行１０００ｒ／ｍｉｎ离心，下同），绘制曲线。在曲线出现最高峰时，测定毕赤酵母重组菌的产量进行比较，选择出最适碳源及最佳比例。１．２．３氮源的确定固定碳源为２．５％玉米淀粉，分别以蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉子粉为氮源，保持其他培养基成分不变进行培养，选择出最佳氮源。然后将最佳氮源按照３.0％、５.0％、７.0％３种不同比例进行培养基配制确定最佳比例。确定方法同“１．２．２”。１．２．４发酵条件的优化１）初始ｐＨ。采用确定好的基础培养基，在温度２８℃、转速２５０ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ｈ、接菌量１．５

8、％、装液量５０ｍＬ／２５