galectin1基因高表达促进胃癌细胞血管生成机制的研究

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1、万方数据高俊：Galectin-1基因高表达促进胃癌细胞血管生成机制的研究(2)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min。(3)取0．01ML柠檬酸盐缓冲液pH6．0(800．1000m1)加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片放入己沸腾的缓冲液中，加热，l～3min后，冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗两次，PBS冲洗两次，每次3min。(4)3％H202去离子水孵育5．15min。(5)滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10．15min。(6)稀释的一抗，4℃过夜。(7)隔夜取出，PBS冲洗。(8)滴加生物素化二抗工作液，孵育10-20min，PB

2、S冲洗。．(9)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，孵育10．20min，PBS冲洗。(10)HE染色(11)中性树脂封片。2．2-3免疫组化染色结果评估免疫组化染色的平均光密度通过ImageProPlus6．0(ImagePro，Bethesda，MD，USA)软件定量分析：采集免疫组化染色图像，每张切片随机取6个大小相等的视野，棕黄色为阳性，计算每一视野中阳性面积百分比，即单位面积内目的蛋白的密度值，然后计算平均值。免疫染色密度评分标准如下：0分：无染色；1分：染色阳性细胞<10％；2分：染色阳性细胞10．50％；3分：染色阳性细胞51．8

3、0％：4分：染色阳性细胞>80％。染色强度评分标准如下：0分：无染色；1分：轻微染色；2分：中等染色；3分：强染色。根据染色的总分将结果分为两类：总分<4分：低表达；总分>4分：高表达。所有标本的分析结果分别由三位不同的研究者在不了解临床资料的前提下独立完成。2．2．4重组慢病毒转染从人类cDNA文库中筛选Oalectin-1基因片段，然后克隆至噬菌体．CMV-MCS．IZsGreen的位于BaIIlHI和Xhol之间的限制性内切酶位点。Galectin一1特殊的寡核苷酸(galectin-1siRNA，≠}1．5’．CCGGGCTGCCA

4、GATGGATACGAATCTCGAGA丌CGTATCCATCTGGCAGCTTTTTTG一3’；galectin一1siRNA≠}2，5’一CCGGCAGCAACCTGAATCTCAAACTCGAGTTTGAGATTCAGGTTGCTGT万方数据扬州大学硕士学位论文TTTTTG一3’)或是无序寡核苷酸r5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG．3’)被转载至空白载体pLKO．1上。重组慢病毒的步骤按照生厂商的推荐步骤进行，完成后将用于转导实验。在病毒转染之前，将CAFs在添加了

5、8lg／mL的聚凝胺的培养基中孵育6h。转染慢病毒后，Galectin-1过表达的CAFs因表达绿色荧光蛋白而从流失细胞仪中分选出来。在含有2lg／mL嘌呤霉素的培养基中，表达敲除质粒的Galectin-1短链RNA的CAFs被分选出来。WesternBlotting和RT-PCR实验证实，Galectin．1在全细胞提取液中表达，按照Galectin．1不同表达程度，将实验分组为：正常胃成纤维细胞(NGF)、肿瘤间质成纤维细胞(CAF)、Galectin—l低表达(Down)和过表达组(Over)。2．2．5HUVECs小管形成实验(1)

6、实验中所有接触Matrigel基质胶的物品均置于．20。C冰箱预冷，然后将Matrigel基质胶置于2～8。C冰盒上融化。将融化后的基质胶加入96孔板，每孔50血，37℃交联1h。(2)每孔种入50I-tL密度为2×105／mlHUVEC内皮细胞，加入相应含有不同分组细胞的培养基，每组设3个复孔。(3)分别于0h、2、4h和8h在倒置显微镜下观察内皮细胞形成小管样结构的情况并拍照。(4)计数视野中小管网状结构中闭合环形小管结构的数目。2．2．6免疫蛋白印记(WesternBlot)将各组细胞裂解在十二烷基硫酸钠缓冲液中，共计1001上g的细

7、胞蛋白按照10％或10-20％的浓度梯度分装到十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶，聚偏二氟乙烯膜封闭，分别加入鼠抗Galectin．1抗体，鼠抗VEGF抗体和鼠抗VEGFR2抗体，4。C过夜。冲洗后，加入兔抗鼠IgG抗体，室温孵育2h。用ECL试剂盒中0【．微管蛋白做对照，显影。2．2．7鸡胚绒毛膜尿囊实验取4日龄受精鸡胚(购自扬州大学比较医学中心)，消毒后在超净台内将气室端(钝头端)开窗1×1cm2大小，去除气室膜，暴露绒毛尿囊膜。无菌明胶海绵裁成2×2ram2大小，加上20旺各组条件培养基，用灭菌透明胶带封闭气室端，放入孵箱在374C，相对

8、湿度为65％的条件下培养。72h后小心去除透明胶带，充分暴露鸡胚绒毛尿囊膜，显微镜下观察血管万方数据高俊：Galectin．1基因高表达促进胃癌细胞血管生成机制的研究1I新生情况