高氧暴露下新生大鼠肺组织及ⅱ型肺泡上皮细胞上皮钠通道的表达与功能研究

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1、·中文论著摘要·高氧暴露下新生大鼠肺组织及Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮钠通道的表达与功能研究刖吾近年来，随着早产儿管理技术和治疗手段的发展，极低和超低出生体重儿的存活率有了明显改善。但随之而来，因肺组织尚未发育成熟，加上吸入高浓度氧气，机械通气，感染等因素影响，使得早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)的发病率在逐年上升。由于目前缺乏有效的监控手段及治疗方法，重患多于生后1年内死亡，即使幸存者，儿童早期呼吸系统疾病的高患病率，以及远期神经发育障碍也严重影响了患儿的生活质量。研究表明炎症反应在BPD发生、发展中发挥了重要作用。由于炎症反

2、应增加了肺泡．毛细血管通透性，大量白蛋白和其它血清蛋白渗出，使得肺水肿成为BPD早期的主要病理表现之一。大量体内研究证实，阿米洛利(amiloride)敏感性上皮钠通道(epithelialsodiumchannel，ENaC)是钠离子从项膜进入极化上皮细胞的主要通道，以对Na+有高度选择性和对亚微摩尔量的阿米洛利敏感为特征，在呼吸道上皮主要由三个同源亚基0t，p和Y组成，与肺内液体清除密切相关，而II型肺泡上皮(alveolarepithelialtypeII，ATII)细胞是实现钠水重吸收的主要功能细胞。以往研究表明ENaC功能障碍不仅与多种病理情况下肺水肿的发生有关

3、，而且决定了肺水肿的预后。然而，有关BPD早期ENaC表达和功能的研究较少，且结论还不明确。因此，本研究采用经典的高氧致新生大鼠BPD模型，利用real．timePCR和westernblot方法观察0t．，p．和?-ENaC亚基mRNA和蛋白表达的动态变化，并同时原代培养新生大鼠的ATII细胞，利用膜片钳技术和流式细胞技术，记录暴露高氧中的ATII细胞阿米洛利敏感性钠电流和阿米洛利敏感性体积变化，以确定高氧暴露下ENaC表达变化与其功能的相关性。方法一、高氧暴露下新生大鼠肺组织ENaC表达检测l、BPD动物模型制备、分组与标本采集：将自然分娩的新生Wistar大鼠，随机

4、分为高氧组和对照组，每组32只。高氧组于生后12小时内放入氧箱中，使箱内Fi02=0．85，C02<0．5‰湿度60"-'70％，温度21"--250C。每天定时与对照组间交换母鼠。对照组以同样护理条件置于空气中。每组分别于高氧暴露后l、3、5和7天随机选取8只鼠，取肺待检。2、Real．timePCR技术检测肺组织0c．、p一和丫一ENaCmRNA表达：利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，利用TIANScriptRTKit反转录合成cDNA，Exicycli雕96荧光定量仪和SYBRGREEN进行荧光定量分析，利用2-AACT法计算ENaCmRNA相对表达量。3、W

5、esternblot技术检测肺组织0【．、p．和7-ENaC蛋白表达：蛋白提取并定量，应用8％凝胶进行SDS．PAGE分离，将蛋白转至PVDF膜，用TBS配置5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，一抗4"C过夜，二抗37℃孵育l小时。应用ECL试剂盒发光，分析图像。二、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC表达检测1、新生大鼠ATII细胞的分离、纯化及鉴定：出生24小时内的Wistar大鼠，无菌取肺，采用胰酶和胶原酶联合消化分离细胞，应用差速贴壁和免疫粘附法纯化细胞，分别于21％02和85％02培养箱内进行原代培养。应用SP—C免疫荧光染色及透射电镜进行细胞鉴定。分别于高氧暴露后1、

6、2和3天收集细胞。2、Real．timePCR技术检测ATII细胞中仅．、p．和丫．ENaCmRNA—o、I表达：方法同一、23、Westemblot技术检测ATII细胞中仅．、p．和丫．ENaC蛋白表达：2方法同一、3．三、高氧暴露下新生大鼠ATII细胞ENaC钠水转运功能检测1、新生大鼠ATII细胞的分离、纯化与培养：同二、l2、膜片钳技术记录全细胞阿米洛利敏感性钠电流：将长有ATII细胞的玻片从培养基中取出，浸入倒置相差显微镜的浴槽中。应用Multiclamp700B膜片钳放大器进行系列阻抗和电容补偿。记录全细胞电流时保持电位．40mV，应用．120至U+80mV，

7、步阶20mV的电位进行电流电压曲线分析。滤波频率为1kHz，采样频率为2kHz。3、流式细胞技术检测阿米洛利敏感性细胞体积变化：记录高氧组与对照组加入和未加入阿米洛利细胞的前向角散射光(FSC)的峰值道数，并计算两者的差值。四、统计分析所有数据以均值士标准差表示。采用独立样本T检验进行相同时间点组间比较，采用单因素方差分析和LSD法t检验进行组内各时间点两两比较。以P<0．05作为差别有统计学意义的标准。结果一、高氧暴露下新生大鼠肺组织ENaC表达1、肺组织中a．ENaC表达：0【．ENaCmRNA表达在高氧暴露l天与对照组比