神经干细胞移植治疗视神经损伤的实验研究

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1、中文摘要摘要视神经损伤(opticnerveinjury，0NI)是颅底骨折的常见并发症，也是致盲的重要因素之一，由于视神经是中枢神经系统的一部分，其损伤后的再生能力非常有限，目前临床尚缺乏行之有效的治疗手段，为此寻找促进神经再生和修复的有效方法成为治疗视神经损伤也是现代神经生物领域的热点。近年来，随着对视神经损伤机制的深入研究，其治疗方法逐渐多样化，周围神经、嗅鞘细胞、雪旺细胞移植及神经营养因子注射等已见较多实验研究报道，虽取得了一定进展，但由于来源限制或组织移植物引起免疫排斥反应、疗效持续性短暂等问题，限

2、制了其临床应用。神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)移植目前在许多中枢神经系统疾病的治疗研究中显示了其巨大的潜力和优势，其中，干细胞移植治疗脑血管疾病、肌萎缩侧索硬化、帕金森综合征、脊髓损伤、青光眼及缺血引起的视力下降等疾病已取得了可喜的成果，由于NSCs具有不断更新、自我增殖和多向分化潜能等特性，使之成为较为理想的移植细胞源。本课题组在以往几年对NSCs培养和移植的相关研究的基础上，采用玻璃体下腔注射NSCs移植治疗视神经部分损伤的动物模型，观察NSCs在视网膜内的存活、迁移与分化，．通过

3、研究NSCs移植后视网膜节细胞的变化及其对视觉电生理的影响，即形态学及功能恢复两个方面来探讨NSCs对0NI的治疗保护作用，并且进一步深入探讨了NSCs对视神经损伤保护功能的机理。由于视神经损伤后神经营养因子的剥夺是导致节细胞凋亡的根本原因之一，而有研究表明NSCs在体外体内均可分泌神经营养因子，那么移植的NSCs是否通过在视网膜内分泌神经营养因子来保护受损视神经呢?本研究对此进行了验证。论文各部分均进行了较为详细的时间分段比较，博：I：学位论文中文摘要以期为基础及临床应用研究提供详细的实验数据。研究包括以下

4、四个部分。第一部分神经干细胞的分离、培养与鉴定目的分离神经干细胞(NSCs)，体外培养传代，诱导其分化并进行鉴定，为应用研究奠定基础。方法从胚胎大鼠的大脑皮层、室管膜下区和海马等部位分离NSCs，用无血清培养技术体外培养、扩增、传代，去除生长因子后诱导NSCs分化，采用免疫荧光技术对NSCs及分化的神经细胞进行鉴定。同时在体外长期培养，建立简单方便的NSCs传代培养技术。结果从胚胎大鼠的大脑皮层、室管膜下区和海马组织可获得大量的NSCs，这些细胞在培养基中自我增殖并分化表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的

5、特异性抗原NeuN、GFAP和MBP。反复传代后这些细胞仍可保持自我增殖及多向分化的潜能。结论胚鼠的NSCs具有自我更新和增殖能力，并具备多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。体外长期传代培养可保持NSCs的基本特性。第二部分神经干细胞在视网膜内的存活、整合和分化目的观察神经干细胞(NSCs)移植后在视神经损伤大鼠视网膜内的存活、整合和分化情况。方法48只健康成年S．D大鼠随机分为A组(视神经损伤组)和B组(对照组)，每组24只，A组使用精确校准方法在大鼠右眼造成部分视神经损伤，随后手术显

6、微镜下，利用体内移植技术，将培养好的NSCs注入右眼玻璃体下腔内；B组正常大鼠，正常右眼玻璃体下腔内注射同等剂量NSCs。以上两组按处死时间的长短各分为四组，分别于注射NSCs后1、2、4、8N处死动物，每时间段6只大鼠。用免疫荧光染色等方法检测观察NSCs在宿主动物视网膜内不同时间段的存活、整合和分化情况。结果白第l周后A组受损lIllI可见NSCs禾I视网膜表层整合，且随时间的延长有向视网膜的深层迁移的趋势，免疫荧光双标染色显示部分NSCs表达MAP2，MBP和GFAP等神经元和神经胶质细胞的特异性标记物

7、，表明移植细胞可朝神经元和神经胶质方向分化。然而它们没有表达HPC一1，calbindin，和rhodopsin等视网膜神经元特异性标记物，说明它们不能分化为视网膜神经细胞。共聚焦显微镜下显示NSCs有突触样结构伸入宿主细胞内。B组正常眼视网膜内未发现NSCs与视网膜整合及分化为神经元等神经细胞。结论NSCs玻璃体下腔移植后能进入成年视神经损伤大鼠的视网膜内存活，并与宿主视网膜整合，形成突触样结构伸入宿主细胞内，部分移植细胞能向神经元及神经胶质细胞分化，但尚不能证实其可分化为视网膜神经细胞；在正常视网膜内未见

8、NSCs整合及分化。第三部分神经干细胞移植对视神经部分损伤后功能修复的影响(一)神经干细胞移植对大鼠视神经部分损伤后节细胞的保护作用目的观察研究神经干细胞(NSCs)移植对视神经部分受损S-D大鼠视网膜节细胞(RGCs)的保护作用。方法48只健康成年S-D大鼠随机分为N组(NSCs移植组)和C组(对照组)，每组24只，两组均使用精确校准方法在成年S．D大鼠右眼造成部分视神经损伤，左眼为正常对照。利用